【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到分子遗传学领域，具体涉及到一种快速鉴别新生裸鼠的引物对、方法及应用。
技术介绍
1、裸鼠是上个世纪60年代偶然发现的，在1966年由科学家flanagan首次提出裸小鼠的概念。1968年，生物学家pantelouris在解剖裸鼠的过程中发现裸鼠的胸腺发育不全。胸腺是t淋巴细胞发育和成熟的关键场所，这样造成了一定的免疫缺陷，其淋巴细胞的数量大大降低，对胸腺依赖的抗原免疫反应非常差，包括不能排斥异体的肿瘤移植物和对感染敏感等。由于裸鼠具有独特的免疫缺陷性，其已经成为生物学和生物医药领域不可缺少的实验动物模型，例如，免疫学、肿瘤学和药品的药效及安全性评价等方面。
2、裸鼠是生物制品质量控制常用的动物模型之一，特别是在生物制品的毒性、成瘤性和致瘤性等方面，新生裸鼠以其独特的优势在生物制品的生物安全性方面是不可或缺的，例如生物制品致瘤性安全评估，动物体内成瘤法是生物制品生产用细胞基质致瘤性检查的标准方法。该方法是按照规定选择动物的种类，以一定量的细胞基质裂解物或者细胞基质dna接种实验动物，培养一段时间后，通过剖检和病理学检查是否有肿瘤细胞生长来判定细胞的致瘤性。fda指出如果细胞基质中疑似含有致瘤病毒或者细胞基质具有成瘤表型，应分别使用细胞裂解液和细胞基质dna在动物水平上进行致瘤性的检查。who组织和中国药典中针对生物制品生产用细胞基质致瘤性检查给出了较为详细的指南。在致瘤性检查的动物实验中，多种动物模型常常被用到，who组织和中国药典建议使用1-3天的新生裸鼠、新生大鼠和新生仓鼠等。
3、纯合
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种快速鉴别新生裸鼠的引物对、方法及应用，具有操作简单，快速，成本低及即时检测等特点。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：
3、本专利技术的第一方面，提供一种快速鉴别新生裸鼠的引物对，包括2条引物：正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；正向引物的核苷酸序列中，3’端第二个碱基c为引入错配碱基。
4、本专利技术的第二方面，提供上述引物对在快速鉴别新生裸鼠中的应用。
5、本专利技术的第三方面，提供上述引物对在制备快速鉴别新生裸鼠的试剂盒中的应用。
6、本专利技术的第四方面，提供利用上述引物对快速鉴别新生裸鼠的方法，包括琼脂糖凝胶电泳法和/或侧向流法。
7、进一步地，侧向流法中，上述2条引物的5’端有标记，1条引物的5’端的标记为biotin，另1条引物的5’端的标记选自fitc或6-fam中的任意一种。
8、进一步地，侧向流法快速鉴别新生裸鼠，包括以下步骤：以新生小鼠基因组dna为模板，利用所述2条引物进行pcr扩增，得到pcr产物，然后利用限制性内切酶smai对pcr产物进行酶切，得到酶切产物，再通过侧向流检测酶切产物来鉴别新生裸鼠；
9、鉴别新生裸鼠的判断标准为：若侧向流试纸条的质控线和检测线均显色，为正常小鼠；若侧向流试纸条的质控线显色且检测线未显色，为裸鼠；若侧向流试纸条质控线和检测线均未出现条带，提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误。
10、进一步地，采用侧向流法时，在所述pcr扩增的反应体系中，2条引物的终浓度为0.04 μm。
11、进一步地，琼脂糖凝胶电泳法快速鉴别新生裸鼠包括以下步骤：以新生小鼠基因组dna为模板，利用权利要求1所述2条引物进行pcr扩增，得到pcr产物，然后利用限制性内切酶smai对pcr产物进行酶切，得到酶切产物，再通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物来鉴别新生裸鼠；
12、鉴别新生裸鼠的判断标准为：若琼脂糖凝胶电泳结果中酶切产物出现一条109 bp的条带，为裸鼠；若琼脂糖凝胶电泳结果中酶切产物出现109 bp和60 bp的两条带，为正常小鼠。
13、进一步地，采用琼脂糖凝胶电泳法时，所述pcr扩增的反应体系为：0.5 μl dna聚合酶，5 μl 5×sf buffer，0.5 μl 10 mm dntp mix，10 μm的2条引物各1 μl，2 μl新生小鼠基因组dna，15 μl nuclease-free water。
14、可选地，上述酶切反应的反应体系为：1 μl限制性内切酶smai，25 μl pcr扩增产物；上述酶切反应的反应条件：37℃，10min。
15、可选地，琼脂糖凝胶电泳的反应条件为：100v，15min。
16、更进一步地，所述的新生小鼠基因组dna的粗提取方法，包括以下步骤：
17、s1.剪取适量的新生小鼠尾部顶端；
18、s2.向s1中的新生小鼠尾部顶端中加入适量的细胞裂解液，充分裂解；
19、s3.将获取的粗制新生小鼠基因组dna冷却至室温，直接进行下一步操作或者放入-20℃以下长期保存。
20、优选地，s2中充分裂解的条件为95℃反应10 min。
21、需要说明的是，新生小鼠的品种为balb/c。
22、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
23、1、本专利技术利用pcr-rflp，针对正常小鼠和裸鼠的foxn1基因的特点，设计一对不完全配对的pcr扩增引物，该引物能够使正常小鼠和裸鼠携带的酶切位点不同，进而实现对新生裸鼠的鉴别，与普通的鉴别方法相比，在不改变其模板的情况下通过设计一对不完全匹配的pcr扩增引物，人为地改变了pcr扩增产物，更加的灵活，更容易进行实验优化。
24、2、本专利技术与常用的pcr-rflp技术相比，其pcr反应结束之后无需对pcr扩增产物进行纯化就能够直接进行酶切反应，大大简化了实验过程，且用时更短。
25、3、本专利技术只需要应用实验室常规的分子实验仪器，包括pcr仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪，与其他kasp或者高分辨率溶解分析（hrm）法相比，对仪器的依赖性低，并且本专利技术的侧向流法快速鉴别新生裸鼠能够实现即时检测。
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1.一种快速鉴别新生裸鼠的引物对，其特征在于，包括2条引物：正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；正向引物的核苷酸序列中，3’端第二个碱基c为引入错配碱基。
2.权利要求1所述的引物对在快速鉴别新生裸鼠中的应用。
3.权利要求1所述的引物对在制备快速鉴别新生裸鼠的试剂盒中的应用。
4.利用权利要求1所述引物对快速鉴别新生裸鼠的方法，其特征在于，包括琼脂糖凝胶电泳法和/或侧向流法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，侧向流法中，所述2条引物的5’端有标记，1条引物的5’端的标记为Biotin，另1条引物的5’端的标记选自FITC或6-FAM中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以新生小鼠基因组DNA为模板，利用所述2条引物进行PCR扩增，得到PCR产物，然后利用限制性内切酶SmaI对PCR产物进行酶切，得到酶切产物，再通过侧向流检测酶切产物来鉴别新生裸鼠；
7.根据权利要求6所述的方
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，琼脂糖凝胶电泳法包括以下步骤：以新生小鼠基因组DNA为模板，利用权利要求1所述2条引物进行PCR扩增，得到PCR产物，然后利用限制性内切酶SmaI对PCR产物进行酶切，得到酶切产物，再通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物来鉴别新生裸鼠；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：0.5 μL DNA聚合酶，5 μL 5×SF Buffer，0.5 μL 10 mM dNTP Mix，10 μM的2条引物各1 μL，2 μL新生小鼠基因组DNA，15 μL Nuclease-free water。
10.根据权利要求6或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的新生小鼠基因组DNA的粗提取方法，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别新生裸鼠的引物对，其特征在于，包括2条引物：正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq idno.2所示；正向引物的核苷酸序列中，3’端第二个碱基c为引入错配碱基。
2.权利要求1所述的引物对在快速鉴别新生裸鼠中的应用。
3.权利要求1所述的引物对在制备快速鉴别新生裸鼠的试剂盒中的应用。
4.利用权利要求1所述引物对快速鉴别新生裸鼠的方法，其特征在于，包括琼脂糖凝胶电泳法和/或侧向流法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，侧向流法中，所述2条引物的5’端有标记，1条引物的5’端的标记为biotin，另1条引物的5’端的标记选自fitc或6-fam中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以新生小鼠基因组dna为模板，利用所述2条引物进行pcr扩增，得到pcr产物，然后利用限制性内切酶smai对pcr产物进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：臧照星，刘愈杰，赵青，刘丽，幸晓莹，徐国东，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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