一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪肠道冠状病毒的多重RT

【技术实现步骤摘要】
一种猪肠道冠状病毒的多重RT
‑
qPCR试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种猪肠道冠状病毒的多重RT
‑
qPCR试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]迄今为止，已确定六种冠状病毒会导致猪的呼吸道疾病或胃肠炎，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCoV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
‑
CoV)。其中， PEDV、TGEV、PDCoV和SADS
‑
CoV为可导致新生仔猪急性胃肠炎的四种猪肠道冠状病毒，这些猪肠道冠状病毒对全世界的养猪业造成了巨大的损失。
[0003]PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科，其为单股正链RNA病毒，呈现球形，直径约为95～90nm，有囊膜；TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子呈多形性，大多为圆形和椭圆形，直径为90～200nm，表面有囊膜；PDCoV属于冠状病毒亚科，其为有囊膜的单股正链RNA病毒；SADS
‑
CoV属于冠状病毒亚科α冠状病毒属。上述四种病毒具有相类似的结构，且它们存在两种或多种混合感染的情况，所以准确区分上述四种病毒存在很大困难。实时定量聚合酶链式反应（real
‑
time RT
‑
qPCR）在目标基因组的定量和检测方面具有很大的优势，具有高特异性、灵敏度和可重复性等优点。但是目前，未有报道能够同时检测多种猪肠道冠状病毒的RT
‑
qPCR方法。因此，建立一种用于同时鉴别检测四种猪肠道冠状病毒的四重RT
‑
qPCR方法，可以为实验室检测区分和研究上述病毒株提供有效技术手段。

技术实现思路

[0004]针对上述不足，本专利技术公开了一种猪肠道冠状病毒的多重RT
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qPCR试剂盒及检测方法，其具有特异性好、灵敏度高等优点，能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
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CoV)，为实验室快速、准确的检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。
[0005]本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种猪肠道冠状病毒的多重RT
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qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGAATGAGCAAATTCGCTG；引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为CAACCCAGAAAACACCCTCAG；探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为JOE
‑
AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA
‑
BHQ1；引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT；引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC；探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为Texas Red
‑
CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG
‑
BHQ2；引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为ATCGACCACATGGCTCCAA；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT；探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为FAM
‑
CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT
‑
BHQ1；引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为TACTGGTCCTCACGCAGATG；引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为ACGATTGCGAACACCAAGAC；探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为Cy5
‑
CAACAGCGACCCAATGCACACCCT
‑
BHQ3。
[0006]所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测PEDV中的N基因。
[0007]所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测TGEV中的M基因。
[0008]所述引物F3、引物R3是用于检测PDCoV中的M基因。
[0009]所述引物F4、引物R4是用于检测SADS
‑
CoV中的N基因。
[0010]一种猪肠道冠状病毒的多重RT
‑
qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：（1）样品处理：采用RNA提取试剂盒对待测样品提取得到总RNA；所述待测样品包括猪肠道组织样品、猪的粪便、猪的肛门拭子样品中的任意一种或多种；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA作为模板进行RT
‑
qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括：10
µ
L的2
×ꢀ
One
‑
Step RT
‑
PCR Buffer III(TaKaRa)，0.4
µ
L的Ex Taq HS (5 U/μL) (TaKaRa)，0.4
µ
L的PrimeScript RT Enzyme Mix II (TaKaRa)，2
µ
L的模板，引物F1和引物R1各0.2
µ
L，0.3μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3
µ
L，0.3μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2
µ
L，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3
µ
L，0.3μL的探针D，余量为无核酸酶水；（3）RT
‑
qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：Step1：42℃反转录5min；Step2：95℃预变性10s；Step3：95℃变性5s，57℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
[0011]进一步的，在步骤（1）中，将采集的猪肠道组织样品加入搅拌器中，接着加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，再取所述混合物加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，然后将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000
×
g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取；当所述待测样品为猪的粪便或猪的肛门拭子样品时，将猪的粪便或猪的肛门拭子样品加入至pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，然后使用涡旋振荡器震荡混匀30秒，接着反复冻融3次，接着在4℃ 下以10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪肠道冠状病毒的多重RT
‑
qPCR试剂盒，其特征在于：包括以下引物和探针：引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGAATGAGCAAATTCGCTG；引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为CAACCCAGAAAACACCCTCAG；探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为JOE
‑
AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA
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BHQ1；引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT；引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC；探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为Texas Red
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CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG
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BHQ2；引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为ATCGACCACATGGCTCCAA；引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT；探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为FAM
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CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT
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BHQ1；引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为TACTGGTCCTCACGCAGATG；引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为ACGATTGCGAACACCAAGAC；探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为Cy5
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CAACAGCGACCCAATGCACACCCT
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BHQ3。2.一种猪肠道冠状病毒的多重RT
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qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品处理：采用RNA提取试剂盒对待测样品提取得到总RNA；所述待测样品包括猪肠道组织样品、猪的粪便、猪的肛门拭子样品中的任意一种或多种；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA作为模板进行RT
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qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括：10
µ
L的2
×ꢀ
One
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：施开创，冯淑萍，龙凤，尹彦文，蒋家霞，黄小武，覃艳然，屈素洁，陆文俊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西壮族自治区屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：