一种三重荧光定量PCR的方法技术

本发明专利技术公开一种三重荧光定量PCR的方法，涉及PCR检测领域。该三重荧光定量PCR的方法，采用荧光定量PCR技术对非洲猪瘟病野毒和疫苗毒进行检测，同时检测ASFV的CD2V基因，MGF360

【技术实现步骤摘要】
一种三重荧光定量PCR的方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，具体为一种三重荧光定量PCR的方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种烈性传染病。根据ASFV的毒力差异，临床上分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型，其中急性型以高热、网状内皮系统出血和高致死率为特征。正因如此，ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，被我国列为一类动物疫病。
[0003]ASFV疫苗株毒力的反强，进一步加大了ASF疫情防控的难度。ASF疫苗的研究最早追溯至20世纪60年代，目前ASF疫苗的种类多样，有ASFV灭活疫苗、ASF减毒活疫苗、ASF亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗等，但试验结果表明，这些疫苗的防控效果均不理想，导致了目前仍未有可用的商品化ASF疫苗。
[0004]ASF的临床症状与猪瘟症状较为相似，大多依赖实验室进行监测诊断，对此，做到早发现、早处理，是保护养猪产业的重要手段。近年来，国内外学者对ASFV建立了普通PCR诊断、SYB Green荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和Taq Man qPCR等核酸技术进行检测。目前，大多方法主要检测P72这个保守区衣壳蛋白基因，无法有效区分野毒株和疫苗株的感染，有些检测方法给出了ASF野毒株和基因缺失株感染，但是无法得出良好的灵敏度，或者检测过程中PCR的反应时间过长，当样本量比较大的时候检测的效率不高。
[0005]因此，本专利技术通过建立三重荧光定量PCR的方法，同时检测ASFV的CD2V基因，MGF360
‑
14L基因和P72基因，可以有效检测是否受ASFV的感染及区分ASFV的野毒株和疫苗株，同时经过优化的引物探针序列有效提高了检测的灵敏度，并且本方法中使用了一种广州阿凡提生物技术有限公司优化过的PCR反应预混液，能将常规PCR的反应时间从90
‑
120min缩短至30
‑
45min以内，十分有效地提高了PCR的检测效率，为ASF的及早及时诊断提供了新的参考方法。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的引物探针组及三重荧光定量PCR检测方法，能够区分野毒株和疫苗株的感染，有效检测是否受ASFV的感染及区分ASFV的野毒株和疫苗株，同时经过优化的引物探针序列有效提高了检测的灵敏度，并且本方法中使用了一种化过的PCR反应预混液，能将常规PCR的反应时间从90
‑
120min缩短至30
‑
45min以内，十分有效地提高了PCR的检测效率，为ASF的及早及时诊断提供了新的参考方法。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种三重荧光定量PCR的方法，采用荧光定量PCR技术对非洲猪瘟病野毒和疫苗毒进行检测，具体包括如下步骤：
[0010]步骤一：试剂准备；
[0011]试剂盒包含PCR反应预混液625μL、PCR扩增反应液375μL、阳性对照250μL和阴性对照250μL；
[0012]步骤二：PCR扩增条件设定；
[0013]PCR扩增条件经试验优化为：
[0014]预变性阶段：温度95℃、升温速率4℃/s、时间2min和循环1次；
[0015]变性阶段：温度95℃、升温速率4℃/s、时间10s和循环45次；
[0016]退火和延伸阶段：温度60℃、升温速率4℃/s、时间15s和循环45次；
[0017]步骤三：实验设计；
[0018]引物探针设计：引物根据NCBI提供的序列信息由Snapgene6.02软件设计,以非洲猪瘟病毒的VP72基因为靶基因，设计特异性引物A
‑
F,和A
‑
R以及探针A
‑
P；以非洲猪瘟病毒的CD2V基因为靶基因，设计特异性引物B
‑
F和B
‑
R，以及探针B
‑
P；以非洲猪瘟病毒的MGF基因为靶基因，设计特异性引物C
‑
F和C
‑
R，以及探针C
‑
P；
[0019]引物探针序列(5
’
端到3
’
端)如下：
[0020]A
‑
F：CTACGGAGGCAATGCGATTA
[0021]A
‑
R：ATGACCACTGGGTTGGTATTC
[0022]A
‑
P：TCCGGGTGCGATGATGATTACCTT5
’
:FAM、3
’
:MGB
[0023]B
‑
F：CACCACTTCCATACATGAACCAT
[0024]B
‑
R：ACACGGTTTAGGTAAGGGAAA
[0025]B
‑
P：ACATGCGTCCCTCAACACAACCACT5
’
:HEX、3
’
:MGB
[0026]C
‑
F：CATAACCCAGCAGAACTCCT
[0027]C
‑
R：AATATGGGCTTATACGTGTTCCTG
[0028]C
‑
P：AACGCCTGTATCCGAACCCCGTCT5
’
:Cy5、3
’
:MGB；
[0029]阳性质粒合成：通过合成非洲猪瘟病毒的VP72、CD2V和MGF基因，克隆到pMAL
‑
C6T载体，获得pMAL
‑
C6T
‑
VP72
‑
CD2V
‑
MGF重组质粒，然后转化至感态细胞培养，提取质粒，作为实验阳性对照；
[0030]步骤四：灵敏度实验测试，采用了25μL的反应体系，每个反应中加入5μL不同浓度的阳性质粒。
[0031]优选的，所述反应PCR条件以95℃预变性2min，95℃变性10S，60℃退火15S，共采用45个循环，总反应时间37min。
[0032]优选的，所述步骤三实验设计中引物根据NCBI提供的序列信息由Snapgene6.02软件设计，以ASFV基因组作为模板，设计引物分别对ASFV的P72、CD2V、MGF
‑
14L所需片段进行扩增。
[0033]优选的，所述步骤三实验设计中普通PCR分别扩增P72、CD2V、MGF
‑
14L片段；
[0034]以实验室保存的pMAL
‑
C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三重荧光定量PCR的方法，其特征在于，采用荧光定量PCR对非洲猪瘟病野毒和疫苗毒进行检测，具体包括如下步骤：步骤一：试剂准备；试剂盒包含PCR反应预混液625μL、PCR扩增反应液375μL、阳性对照250μL和阴性对照250μL；步骤二：PCR扩增条件设定；PCR扩增条件经试验优化为：预变性阶段：温度95℃、升温速率4℃/s、时间2min和循环1次；变性阶段：温度95℃、升温速率4℃/s、时间10s和循环45次；退火和延伸阶段：温度60℃、升温速率4℃/s、时间15s和循环45次；步骤三：实验设计；引物探针设计：引物根据NCBI提供的序列信息由Snapgene6.02软件设计,以非洲猪瘟病毒的VP72基因为靶基因，设计特异性引物A
‑
F,和A
‑
R以及探针A
‑
P；以非洲猪瘟病毒的CD2V基因为靶基因，设计特异性引物B
‑
F和B
‑
R，以及探针B
‑
P；以非洲猪瘟病毒的MGF基因为靶基因，设计特异性引物C
‑
F和C
‑
R，以及探针C
‑
P；引物探针序列(5
’
端到3
’
端)如下：A
‑
F：CTACGGAGGCAATGCGATTAA
‑
R：ATGACCACTGGGTTGGTATTCA
‑
P：TCCGGGTGCGATGATGATTACCTT5
’
:FAM、3
’
:MGBB
‑
F：CACCACTTCCATACATGAACCATB
‑
R：ACACGGTTTAGGTAAGGGAAAB
‑
P：ACATGCGTCCCTCAACACAACCACT5
’
:HEX、3
’
:MGBC
‑
F：CATAACCCAGCAGAACTCCTC
‑
R：AATATGGGCTTATACGTGTTCCTGC
‑
P：AACGCCTGTATCCGAACCCCGTCT5
’
:Cy5、3
’
:MGB；阳性质粒合成：通过合成非洲猪瘟病毒的VP72、CD2V和MGF基因，克隆到pMAL
‑
C6T载体，获得pMAL
‑
C6T
‑
VP72
‑
CD2V
‑
MGF重组质粒，然后转化至感态细胞培养，提取质粒，作为实验阳性对照；步骤四：灵敏度实验测试，采用了25μL的反应体系，每个反应中加入5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凤，宋燕婷，李海涛，
申请(专利权)人：广州阿凡提生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：