一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法技术

本发明专利技术公开一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法，涉及双靶点LAMP可视化检测领域。该非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法，解决Q

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法


[0001]本专利技术涉及双靶点LAMP可视化检测
，具体为一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，通常表为全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，对受灾国的养猪业造成严重的影响[1]。自1921年肯尼亚首次报道ASF以来，疫情已经席卷全球多个地区，由于ASFV生物学特性比较复杂，迄今仍未能研制出安全有效的疫苗。一旦发生ASF就会在该地区形成一个新的ASF流行区域，并出现向更大范围扩散的趋势，因此,该病被世界动物卫生组织(OIE)录入法定报告的动物疫病之中，我国也将其列为一类动物传染病。
[0003]非洲猪瘟疫情于2018年在我国开始爆发，截至当年11月初，累计报告58次疫情，覆盖全国14个省(市、区)的33个地市，我国为控制疫情蔓延，扑杀47万头生猪。此次疫情导致中国的生猪存栏量下降了40％以上，同时也使全球生猪存栏量减少了四分之一。
[0004]近年相关报道非洲猪瘟疫情出现病毒新变种，具有不易被发现，传播能力强，且更难被控制的特点。
[0005]荧光定量PCR检测是非洲猪瘟常用的检测手段，它是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，来确定是否含有病毒模板，常常作为分子鉴定和载量分析，应用于生物医药等领域的检测。具有特异性强、有效解决PCR污染问题等优点。可是，荧光定量PCR往往需要特定的Q
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PCR扩增仪，检测场所也有所限制，难以在生产养殖现场普及，并且实验时间也相对较长。
[0006]本方案运用的技术为环介导等温扩增技术(LAMP),该方法是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合(Bst DNA polymerase)在等温条件下进行扩增反应，30
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60分钟内即可实现目标基因109
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1010倍的扩增。反应过程中会产生大量焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在，还可以通过添加荧光染料、比色染料等观察荧光或颜色变化判断有无靶基因[7]，已被广泛应用于兽疫、植物病害、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中[8][6]。
[0007]LAMP方法的优势除了具有Q
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PCR的高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，并且在应用阶段对仪器的要求低，仅需简单的恒温装置就能完成反应。结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀、绿色荧光或颜色变化即可，不同于Q
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PCR方法需要专业的仪器观察结果，大大节约了仪器的成本，是一种适合现场、基层快速检测的方法。
[0008]P72是在病毒感染后期表达的主要结构蛋白[9]，是ASFV二十面体衣壳的主要成分，在各种毒株类型中相对保守，是检测ASFV的重要靶点；

技术实现思路

[0009](一)解决的技术问题
[0010]针对现有技术的不足，本专利技术为解决Q
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PCR检测ASFV过程中需要贵重仪器、需要专业人员、不便于ASFV的现场检测的问题，本方案采用LAMP检测ASFV，运用LAMP具有快捷、灵敏度高、操作简单、仪器简单、观测简单的优势，着重解决了Q
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PCR这方面的限制，仅需一个恒温水浴锅61
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65℃加热30分钟即可检测是否感染ASFV。极大的方便了农户、小型猪场、防疫人员的现场检测，可以对非洲猪瘟的防治做出更快速的反应。并且LAMP的实验过程只需一步加入反应混合物，无需二次开盖操作，有效规避了气溶胶污染风险。
[0011]在非洲猪瘟的检测中，鉴别其感染类型十分重要，特别是鉴别其感染的类型是野生强毒株还是免疫弱毒株。本方案针对这个迫切的需求，开发了针对非洲猪瘟P72与CD2v基因的双靶点LAMP可视化检测试剂盒，在检测是否感染ASFV的同时还可以区分感染类型，极大的方便了农户与小型猪场对非洲猪瘟的防治。本方案为ASF的现场诊断提供一种操作简单、快速精准、低成本的选择是基层检测的优选方法。
[0012](二)技术方案
[0013]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法包括如下检测步骤；
[0014]步骤一：采用环介导等温扩增技术对非洲猪瘟病野毒和疫苗毒进行检测，含有以下材料：
[0015](1)恒温水浴锅；
[0016](2)LAMP工作液；
[0017](3)P72基因内引物外引物环引物；
[0018](4)CD2V基因内引物外引物环引物；
[0019]步骤二：实验设计：
[0020](1)阳性质粒克隆；
[0021]f)引物设计；引物根据NCBI提供的序列信息由SnapGene6.02软件设计，以ASFV基因组作为模板，设计引物分别对ASFV的P72、CD2V所需片段进行扩增；
[0022]g)普通PCR分别扩增P72、CD2V片段；
[0023]h)重叠延伸PCR反应扩增P72
‑
CD2V(2L)；
[0024]i)2L片段与pTOPO
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BluntⅡ载体相连接后转化入DH5
ɑ
感受态细胞；
[0025]j)菌液PCR鉴定阳性菌及测序；
[0026](2)LAMP实验
[0027]本次测试采用了25μl的反应体系，每个反应中加入阳性质粒，将引物按(外引物：环引物：内引物＝1：4：8＝0.2μM：0.8μM：1.6μM)的比例配置成工作液；
[0028](3)灵敏度反应
[0029]将阳性质粒进行10倍梯度稀释，稀释至10^10倍，以梯度稀释的质粒为模板进行LAMP反应，观察颜色是否发生变化，同时以稀释后质粒为模板进行Q
‑
PCR反应，观察结果比较二者的灵敏度；
[0030](4)特异性实验
[0031]将保存的ASFV
‑
MGF、ASFV
‑
P72、ASFV
‑
CD2v、PRRSV基因分别作为模板，反应体系进
行LAMP反应，若有P72及CD2v组有颜色变化，说明引物异特性好；
[0032](5)数据分析
[0033]通过观察反应液颜色变化来判断是否有病毒和区别感染类型；
[0034](6)结果展示
[0035]a)LAMP反应：
[0036]以CD2v引物与P72引物对阳性质粒进行LAMP扩增，结果显示P72组与CD2v组均在30
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40min产生颜色变化，说明体系构建成功，极大缩短了检测的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟感染与免疫的双靶点LAMP可视化检测方法，其特征在于包括如下检测步骤；步骤一：采用环介导等温扩增技术对非洲猪瘟病野毒和疫苗毒进行检测，含有以下材料：(1)恒温水浴锅；(2)LAMP工作液；(3)P72基因内引物外引物环引物；(4)CD2V基因内引物外引物环引物；步骤二：实验设计：(1)阳性质粒克隆；a)引物设计；引物根据NCBI提供的序列信息由SnapGene6.02软件设计，以ASFV基因组作为模板，设计引物分别对ASFV的P72、CD2V所需片段进行扩增；b)普通PCR分别扩增P72、CD2V片段；c)重叠延伸PCR反应扩增P72
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CD2V(2L)；d)2L片段与pTOPO
‑
BluntⅡ载体相连接后转化入DH5
ɑ
感受态细胞；e)菌液PCR鉴定阳性菌及测序；(2)LAMP实验本次测试采用了25μl的反应体系，每个反应中加入阳性质粒，将引物按(外引物：环引物：内引物＝1：4：8＝0.2μM：0.8μM：1.6μM)的比例配置成工作液；(3)灵敏度反应将阳性质粒进行10倍梯度稀释，稀释至10^10倍，以梯度稀释的质粒为模板进行LAMP反应，观察颜色是否发生变化，同时以稀释后质粒为模板进行Q
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PCR反应，观察结果比较二者的灵敏度；(4)特异性实验将保存的ASFV
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MGF、ASFV
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P72、ASFV
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CD2v、PRRSV、SARS
‑
COV
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2基因分别作为模板，反应体系进行LAMP反应，若有P72及CD2v组有颜色变化，说明引物异特性好；(5)数据分析通过观察反应液颜色变化来判断是否有病毒和区别感染类型；(6)结果展示a)LAMP反应：以CD2v引物与P72引物对阳性质粒进行LAMP扩增，结果显示P72组与CD2v组均在30
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40min产生颜色变化，说明体系构建成功，极大缩短了检测的时间；b)以阳性质粒为模板进行梯度稀释，分别进行Q
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PCR反应与LAMP反应，发现LAMP反应的灵敏度强于Q
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PCR反应；c)特异性实验以ASFV
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MGF、ASFV
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P72、ASFV
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CD2v、PRRSV基因分别作为模板，反应体系进行LAMP反应，观察结果发现只有P72、CD2v组有颜色变化，其他基因实验组无颜色变化，说明引物异特性好，无非特异性扩增。2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟感...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凤，宋燕婷，
申请(专利权)人：广州阿凡提生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：