本发明专利技术公开一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，涉及数字PCR的检测领域。该用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法包括材料的准备、样本稀释、检验操作、反应体系配置、数字PCR反应和数据分析等步骤。该用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，具有更高的检测灵敏度，核酸定量实现无需标准品，也不依赖于标准曲线，采用终点PCR信号计数检测不依赖于Ct值，从而避免了由于标准品与样品基质不同产生的定量误差，能有效克服PCR抑制剂的影响，是一种更加理想的进行基因扩增检测和核酸定量分析的新方法。核酸定量分析的新方法。核酸定量分析的新方法。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法
[0001]本专利技术涉及数字PCR的检测
，具体为一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法。
技术介绍
[0002]猪圆环病毒病是由圆环病毒引起的一种多系统性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、增生性坏死性肺炎和繁殖障碍性疾病等，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，同时可导致免疫抑制，进而导致继发感染或混合感染，给全球养猪业造成了巨大的经济损失；
[0003]病毒病的确诊均需进行病毒分离。但由于PCV在细胞上不产生细胞病变且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖，因此病毒分离费力、耗时，不适于此病的快速诊断。
[0004]目前已有多种市售诊断试剂盒，如ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)等但其非特异性较高，而传统的常规PCR和实时荧光PCR等检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足；常规PCR操作复杂，需进行凝胶电泳分析，并且灵敏度低；多重荧光PCR方法能够1次检测2种或多种病原，具有快速、高效的优点，可以大大地缩短检测时间并节约成本；
[0005]目前已经广泛应用动物病原的检测，却具有需依赖标准曲线进行定量检测，而且对样本中模板浓度有一定要求，无法检测病毒感染初期的低浓度病毒模板，灵敏度仍存在一定的局限性。
[0006]因此，本技术建立了一种特异、灵敏、可靠地且同时检测和鉴别PCV2/3/4的三重数字PCR方法，根据报道的PCV基因序列设计合成三种PCV基因型特异性引物，在保持了普通PCR特异性强、灵敏度高的优点，同时它能够在一个PCR反应管中，同时扩增多个目的片段，再者数字PCR的灵敏度更高，可以检测到痕量的病毒，对圆环2/3/4型病毒的早期诊断有着重要的意义，而且本方法可以同时检测猪圆环2/3/4型3种病毒，具有节约时间、人力和物力的优点，能够对疾病做到快速、准确的诊断。
技术实现思路
[0007](一)解决的技术问题
[0008]针对现有技术的不足，本技术专利技术的目的在于针对现有PCV的检测技术的不足，寻找能够对PCV2/3/4同时鉴别检测的准确、高效技术的方法。
[0009](二)技术方案
[0010]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，包括如下操作步骤：
[0011]步骤一：材料的准备；
[0012](1)数字PCR板(Qiagen)；
[0013](2)QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液(Qiagen)；
[0014](3)PVC2引物1F/R:F 5'
‑
CGCAAGAAAATACGGGAGCT
‑
3'
[0015]R 5'
‑
CGTCCTTCCTCATTACCCTCC
‑
3'；
[0016]10μL/mL，(华大六合)；
[0017](4)PVC3引物2F/R:F 5'
‑
CAGTGCTCCCCATTGAACG
‑
3'
[0018]R 5'
‑
CCAGGACAAAGCCTCTTCTTTT
‑
3；10μL/mL，(华大六合)；
[0019](5)PVC4引物3F/R:F 5'
‑
CCACATAGTCTCCATCCAGTTG
‑
3'
[0020]R 5'
‑
CCTCCCATTTGCATATTACCGGA
‑
3'；
[0021]10μL/mL，(华大六合)；
[0022](6)探针1:AATCTCCCTTTTTGATTATTTTATTGTTGGCG、5
’
:6
‑
carboxy
‑
fluorescein(FAM)、3
’
:3`BHQ1；(华大六合)
[0023](7)探针2:TCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCT、5
’
:6
‑
carboxy
‑
fluorescein(HEX)、3
’
:3`BHQ1；(华大六合)
[0024](8)探针3:AGTGCTAGAGTAAGTCCTATTACTGTTAATGC、5
’
:6
‑
carboxy
‑
fluorescein(CY5)、3
’
:3`BHQ1；(华大六合)
[0025]步骤二：样本稀释；
[0026]测试采用不同稀释倍数的阳性质粒，以测试本试剂盒检测猪圆环三重病毒的灵敏度，稀释倍数为1X、2X、4X、8X、16X、32X、64X、128X、256X；
[0027]步骤三：检验操作；
[0028]对猪圆环三重病毒的PCV2/3/4基因片段进行了采用Taq
‑
Man探针荧光信号检测，采用一个猪圆环三重阳性质粒进行平行测试，分别标记为：样本1
‑
1、样本1
‑
2；
[0029]步骤四：反应体系配置；
[0030]采用了40μL的反应体系，每个反应中加入4μL不同浓度的阳性质粒；
[0031]步骤五：数字PCR反应；
[0032]将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字PCR板的加样孔中，过程中应避免有气泡产生；
[0033]步骤六：数据分析；
[0034]采用QIAcuity数字PCR仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数；
[0035]步骤七：结果分析；
[0036]阳性模板检测结果显示，核酸拷贝数显示，所测之阳性样本均显示出阳性拷贝数，而阴性对照则无阳性质粒的拷贝数。
[0037]优选的，所述步骤四中反应体系配置时全程无需在冰上操作，探针需避光保存，阴性对照组中不含猪圆环三重阳性样本，加入同体积的ddH2O补齐反应体系体积。
[0038]优选的，所述步骤五中加样后用配套封板膜封住PCR板，将数字PCR板按标识放入QIAcuity数字PCR仪中，以37℃UNG处理2min，95℃预变性5min，95℃变性10S，60℃退火30S，共采用45个循环。
[0039]优选的，所述步骤六中按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数，如本检测中，采用40μL体系，其中共有阳性样本4μL，稀释倍数为10倍，结果中的模板拷贝数应X10即为阳性模板中猪圆环三重病毒的实际拷贝数。
[0040]本专利技术公开了一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，其具备的有益效果如下：
[0041]该用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，具有更高本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒三重数字PCR的检测方法，其特征在于，包括如下操作步骤：步骤一：材料的准备；(1)数字PCR板(Qiagen)；(2)QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液(Qiagen)；(3)PVC2引物1F/R:F 5'
‑
CGCAAGAAAATACGGGAGCT
‑
3'R 5'
‑
CGTCCTTCCTCATTACCCTCC
‑
3'；10μL/mL，(华大六合)；(4)PVC3引物2F/R:F 5'
‑
CAGTGCTCCCCATTGAACG
‑
3'R 5'
‑
CCAGGACAAAGCCTCTTCTTTT
‑
3；10μL/mL，(华大六合)；(5)PVC4引物3F/R:F 5'
‑
CCACATAGTCTCCATCCAGTTG
‑
3'R 5'
‑
CCTCCCATTTGCATATTACCGGA
‑
3'；10μL/mL，(华大六合)；(6)探针1:AATCTCCCTTTTTGATTATTTTATTGTTGGCG、5
’
:6
‑
carboxy
‑
fluorescein(FAM)、3
’
:3`BHQ1；(华大六合)(7)探针2:TCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCT、5
’
:6
‑
carboxy
‑
fluorescein(HEX)、3
’
:3`BHQ1；(华大六合)(8)探针3:AGTGCTAGAGTAAGTCCTATTACTGTTAATGC、5
’
:6
‑
carboxy...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱凤，张翩，宋燕婷，
申请(专利权)人：广州阿凡提生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。