一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合及其应用，所述引物和探针组合包括检测戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因的引物和探针组合；所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术所述引物和探针组合能够高效、准确的检测出所有人源和猪源的HEV基因组，并且不受大量背景细胞核酸的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HEV病毒污染。胞库中的HEV病毒污染。胞库中的HEV病毒污染。

【技术实现步骤摘要】
一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是一种单股正链RNA病毒，基因组长约7.7kb，病毒颗粒呈球形，直径27
‑
34nm，无囊膜包裹，核衣壳呈二十面体对称。HEV属于肝炎病毒科、正肝炎病毒属和A型正肝炎病毒，包括7种基因型：基因型1
‑
7。基因型1
‑
2目前仅见于人类；基因型3
‑
4为人兽共患，在包括猪、野猪和鹿在内的几种动物中流行，在人群中偶有感染发生；基因型5
‑
6目前仅发现在野猪群中流行；基因型7在骆驼中流行，但在2016年有报道人感染HEV 7型的案例。人源和猪源戊型肝炎病毒(基因型1
‑
4)因与人类生产生活密切相关，受到了更多的关注和研究。
[0003]戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒引起的一种病毒性人兽共患传染病。HEV通常会导致肝衰竭、慢性肝炎以及肝外神经和肾脏疾病，该病主要通过粪
‑
口途径传播，也可以通过血液传播。据估计，全球每年约有2000万人感染HEV，年轻人病死率为0.5
‑
3.0％，而孕妇感染后死亡率可高达30％，因此HEV对公共卫生安全构成了巨大的威胁。
[0004]戊型肝炎呈全球分布，以暴发流行或散发感染的形式存在，除在人群中流行外，猪感染HEV的现象也非常普遍，但一般不表现出症状。HEV在实验室中可以感染一系列细胞，包括肝细胞、肺细胞、结肠上皮细胞等，因此，来源于人或者猪的材料或者生产过程中使用了人或者猪源材料的细胞培养物以及生物制品可能有携带HEV的风险。
[0005]HEV有多种检测手段，例如病毒分离鉴定、针对病毒蛋白的抗体检测、核酸扩增技术等。病毒分离鉴定往往检测周期长且灵敏度低；适用范围较少。CN104792987B公开了一种用于诊断戊型肝炎病毒感染的方法和试剂盒，用于诊断受试者是否感染了戊型肝炎病毒(HEV)，其包括：(1)测定来自所述受试者的尿液样品中戊型肝炎病毒抗原(HEV
‑
Ag)的存在；和(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎；其中，HEV
‑
Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试者感染了HEV或者患有戊型肝炎。但是，抗体检测技术灵敏度较低，不适用于培养细胞的检测，使用范围受到限制。
[0006]以核酸扩增技术为基础的检测方法是检测戊型肝炎病毒(HEV)感染的主要方法，该技术适用范围广，且灵敏度较高，是一种较好的选择。目前，常用的核酸检测技术为逆转录酶实时荧光定量PCR(Reverse transcriptase Quantitative Real
‑
time PCR)法。该方法首先将病毒RNA反转录为cDNA，之后在PCR扩增过程中，通过检测荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出HEV基因组。
[0007]目前，关于HEV病毒qPCR检测方法只针对人源或者猪源HEV分别进行检测，或者均不能保证覆盖两种来源的HEV，使用范围受限，且并没有专门针对生物制品中的HEV病毒的实时定量PCR检测方法。因此，提供一种适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HEV病毒污染的，且具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量
PCR法在生物制品质量控制中具有重要的应用前景。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合及其应用。本专利技术通过对NCBI数据库中人源和猪源HEV基因组(人源33条，猪源48条，主要针对HEV基因型1
‑
4)做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，所述引物和探针组合能够高效、准确的检测出所有人源和猪源的HEV基因组，并且不受大量背景细胞核酸的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HEV病毒污染。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因的引物和探针组合；
[0011]所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；
[0012]所述正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；
[0013]所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
[0014]正向引物1(SEQ ID NO:1)：TATGCTGCCCGCGCCA；
[0015]反向引物1(SEQ ID NO:2)：TTGGTTGGATGAATATAGGG；
[0016]探针1(SEQ ID NO:3)：FAM
‑
ATCAACCCKGTCACCCCAGAA
‑
MGB。
[0017]本专利技术中，所述引物和探针组合能够检测出NCBI数据库中人源和猪源的HEV(人源33条，猪源48条，针对HEV基因型1
‑
4)基因组，本专利技术中所述引物扩增的区域是HEV基因组中非常保守的区域，对于将来新出现的变异株被本专利技术的引物和探针组合检测到的几率很高，具有重要的应用价值。
[0018]优选地，所述探针的5
’
端修饰荧光素，所述探针的3
’
端修饰淬灭剂。
[0019]优选地，所述荧光素选自FAM、VIC或HEX任意一种。
[0020]优选地，所述淬灭剂选自MGB、BHQ或TAMRA任意一种。
[0021]优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:4所示。SEQ ID NO:4：
[0022]TGGAATGAATGAATAACATGTGCTCTTGCTCTGTGCATGGGGATGCCACCATGCGCTCTCGGGCTCTTCTGTTTTTGCTCTTCGTGCTTTTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGGCCGGTCAGCCGTCTGGCCGTCGCCGCGGGCGGCGCAGCGGCAGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAACCCTTCGCCATCCCCTATATTCATCCAACCAACCCCTTCGCATCTGATATATCAACCACAGCCGGGGCTGGAGCTCGCCCTCGGCAGCCAGTCCGTCCACTCGGCTCCGCTTGGCGCGACCAATCCC。
[0023]第二方面，本专利技术提供一种检测戊型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测戊型肝炎病毒的引物和探针组合。
[0024]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Mix 1
×
、800
‑
900nM正向引物、800
‑
900nM反向引物、220
‑
250nM探针；所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：52
‑
56℃，28
‑
32min；步骤2：94
‑
96℃，8
‑
12min；步骤3：94
‑
96℃，13
‑
17sec；步骤4：58
‑
62℃，0.8
‑
1.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：董元舒，刘存昌，梁艳，童涌，
申请(专利权)人：苏州药明检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：