一种检测多种对虾病原的引物组合物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测多种对虾病原的引物组合物，包括病原EHP引物组、病原VpAHPND引物组、病原DIV1引物组和病原WSSV引物组，本发明专利技术还涉及包括上述引物组合物的试剂盒，该试剂盒还包括微流控芯片阴性对照和恒温扩增反应试剂。该试剂盒可用于检测多种对虾病原，与现有技术相比，本发明专利技术在同一微流控芯片上可同步检测4种对虾病原，提升了检测效率，缩短了检测时间，反应液中Na3Ct

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种对虾病原的引物组合物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及一种检测多种对虾病原的引物组合物、试剂盒及检测方法，属于对虾病原检测


技术介绍

[0002]近些年，水产养殖业中，由于部分养殖户一味追求对虾养殖的高产量，肝肠胞虫(EHP)、急性肝胰腺坏死症弧菌(VpAHPND)和十足目虹彩病毒(DIV1)、白斑综合征病毒(WSSV)等感染呈现上升的趋势，后续调水、改底的产品以及发病后药品的滥用，均大大制约了对虾产量和品质的提升。对虾一旦被上述病原侵染，便无法治愈，加之管理不善，往往给对虾养殖产业造成巨大损失。因此，在养殖各环节进行病原的快速检测，是预防对虾疾病暴发的最为有效的手段。
[0003]目前，病原检测相关标准多采用传统PCR、巢式PCR法、LAMP方法、实时荧光定量PCR法和核酸探针法等。快检方法虽然较多，但都存在一定的局限性。其中，传统PCR虽较为经典，但其反应需要在多个不同的温度区循环，对仪器要求高，检测时长和检测成本相对较高，同时传统PCR扩增仅有1对引物，扩增特异性难以保证，操作专业程度较高，微量加样步骤较多；巢式PCR和LAMP技术虽然都有两对引物，提升了扩增特异性，但前者仍然离不开繁琐的微量加样步骤和仪器的依赖，后者由于是恒温反应，缺少了类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段易产生非特异性扩增从而影响最终的检测结果；免疫荧光法和间接ELISA法均受限于病原对应抗体的缺失而难以大面积普及，且样品储存和运输时的温度对检测结果影响较大；荧光PCR技术中，荧光探针的荧光素标记见光易分解，需要避光保存，荧光探针合成费用和荧光PCR仪器高昂的费用都提升了检测成本。另外，上述检测方法对仪器要求高，操作和分析人员必须具备一定的专业知识背景，无论是在仪器、设备条件上，还是在技术门槛上都有很大的局限性，大大影响了相关检测技术的应用推广。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种检测多种对虾病原的引物组合物。
[0005]本专利技术的目的还在于提供一种检测多种对虾病原的试剂盒。
[0006]本专利技术的第三目的还在于提供一种检测多种对虾病原的方法，该方法可提升检测效率，缩短检测时间，检测成本低，检测结果可视化程度高，并且检测结果准确、可靠。
[0007]技术方案
[0008]一种检测多种对虾病原的引物组合物，包括病原EHP引物组、病原VpAHPND引物组、病原DIV1引物组和病原WSSV引物组；
[0009]所述病原EHP引物组包括：SEQ ID No:1所示的引物EHP
‑
F1、SEQ ID No:2所示的引物EHP
‑
R1、SEQ ID No:3所示的引物EHP
‑
F2、SEQ ID No:4所示的引物EHP
‑
R2；
[0010]所述病原VpAHPND引物组包括：SEQ ID No:5所示的引物VpAHPND
‑
F1、SEQ ID No:6
所示的引物VpAHPND
‑
R1、SEQ ID No:7所示的引物VpAHPND
‑
F2、SEQ ID No:8所示的引物VpAHPND
‑
R2；
[0011]所述病原DIV1引物组包括：SEQ ID No:9所示的引物DIV1
‑
F1、SEQ ID No:10所示的引物DIV1
‑
R1、SEQ ID No:11所示的引物DIV1
‑
F2、SEQ ID No:12所示的引物DIV1
‑
R2；
[0012]所述病原WSSV引物组包括：SEQ ID No:13所示的引物WSSV
‑
F1、SEQ ID No:14所示的引物WSSV
‑
R1、SEQ ID No:15所示的引物WSSV
‑
F2、SEQ ID No:16所示的引物WSSV
‑
R2。
[0013]一种检测多种对虾病原的试剂盒，包括上述检测多种对虾病原的引物组合物，所述试剂盒还包括圆形的微流控芯片，所述微流控芯片包括4个互不连通的测试区，每个测试区包括两个加样孔和8个互不连通的反应池，加样孔靠近圆形微流控芯片的圆心，反应池等距分布于圆形微流控芯片的边缘，每个加样孔与四个反应池通过毛细管连通。
[0014]进一步，所述试剂盒还包括恒温扩增反应试剂和阴性对照，所述阴性对照为无菌水。
[0015]进一步，所述恒温扩增反应试剂包括20mM Tris
‑
HCl、20mM KCl、40mM(NH4)2SO4、40mM MgSO4、2.8mM dNTPs、8000U/mL DNA聚合酶、50μM SYBR Green荧光染料、8
×
10
‑6M Na3Ct
‑
AuNPs和ddH2O。
[0016]进一步，所述Na3Ct
‑
AuNPs的制备方法为：取50mL质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液匀速搅拌并加热至沸腾，剧烈搅拌下迅速加入1.5mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，调节pH至7.2后继续煮沸15min，冷却后补充蒸馏水恢复到原体积，得到Na3Ct
‑
AuNPs溶液。
[0017]一种检测多种对虾病原的方法，包括如下步骤：
[0018](1)将上述引物组合物中的每个引物组分别预埋在微流控芯片上相应的反应池内待用；
[0019](2)提取待检对虾的DNA；
[0020](3)取恒温扩增反应试剂与待检对虾的DNA混合，得到反应液，将其加入到微流控芯片上的加样孔中，然后用配套的透明封口膜重新将整个微流控芯片密封起来，放置到微流控芯片扩增仪中，反应液在离心力作用下流入反应池内，随后进行恒温扩增反应；
[0021](4)恒温扩增反应结束后，读取反应后的实时荧光数值和Ct值，进行结果判定。
[0022]进一步，步骤(3)中，所述恒温扩增反应的温度为63.5℃，时间为30min。
[0023]进一步，步骤(4)中，结果判定的方法为：30min内，待检样品出现特S型异性曲线扩增曲线，且Ct值小于30时判定为阳性结果；30min内，待测样品未扩增出S型特异性曲线，且Ct值小于30时判定为阴性结果。
[0024]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种检测多种对虾病原的引物组合物、试剂盒及检测方法，与现有技术相比，具有以下优点：
[0025]1)本专利技术在同一个微流控芯片上可同步检测4种对虾病原，提升了检测效率，缩短了检测时间；
[0026]2)Na3Ct
‑
AuNPs的加入，优化了该微流控芯片联检方法，提升了扩增效率，缩短了反应时间；
[0027]3)本专利技术方法的检测结果可视化程度高，结果判读人为因素影响较小；
[0028]4)本专利技术方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多种对虾病原的引物组合物，其特征在于，包括病原EHP引物组、病原VpAHPND引物组、病原DIV1引物组和病原WSSV引物组；所述病原EHP引物组包括：SEQ ID No:1所示的引物EHP
‑
F1、SEQ ID No:2所示的引物EHP
‑
R1、SEQ ID No:3所示的引物EHP
‑
F2、SEQ ID No:4所示的引物EHP
‑
R2；所述病原VpAHPND引物组包括：SEQ ID No:5所示的引物VpAHPND
‑
F1、SEQ ID No:6所示的引物VpAHPND
‑
R1、SEQ ID No:7所示的引物VpAHPND
‑
F2、SEQ ID No:8所示的引物VpAHPND
‑
R2；所述病原DIV1引物组包括：SEQ ID No:9所示的引物DIV1
‑
F1、SEQ ID No:10所示的引物DIV1
‑
R1、SEQ ID No:11所示的引物DIV1
‑
F2、SEQ ID No:12所示的引物DIV1
‑
R2；所述病原WSSV引物组包括：SEQ ID No:13所示的引物WSSV
‑
F1、SEQ ID No:14所示的引物WSSV
‑
R1、SEQ ID No:15所示的引物WSSV
‑
F2、SEQ ID No:16所示的引物WSSV
‑
R2。2.一种检测多种对虾病原的试剂盒，包括权利要求1所述检测多种对虾病原的引物组合物。3.如权利要求2所述检测多种对虾病原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括圆形的微流控芯片，所述微流控芯片包括4个互不连通的测试区，每个测试区包括两个加样孔和8个互不连通的反应池，加样孔靠近圆形微流控芯片的圆心，反应池等距分布于圆形微流控芯片...

【专利技术属性】
技术研发人员：王李宝，万夕和，黎慧，史文军，乔毅，沈辉，成婕，于志君，赵然，黄欣桐，全德润，顾晨，
申请(专利权)人：江苏省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：