【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT
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RAA荧光型检测方法
[0001]本专利技术涉及了猪繁殖与呼吸综合征检测
,具体的是一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT
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RAA荧光型检测方法。
技术介绍
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是威胁全球养猪业发展的最重要主要疾病之一。PRRSV感染各年龄段的猪,但妊娠母猪和仔猪的临床表现最严重。妊娠母猪感染PRRSV部分会导致流产,胎儿部分自溶和木乃伊胎,而感染PRRSV的幼猪会出现发烧、严重呼吸困难、厌食、嗜睡、眼皮水肿,耳朵或臀部的出现蓝色等典型临床特征。到目前为止HP
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PRRSV样和NADC30样毒株仍是主要的野生流行毒株,临床检出率较高。
[0003]PRRSV属套式病毒目,动脉炎病毒科,它与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EVA)、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)和猴出血热病毒(Simian hemmorrhagic fevervieus,SHFV)同属动脉炎病毒属。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。它的基因组大小约为15.4kb,5
’
和3
’
端分别有非编码区,包含至少10个开放阅读框(ORF)。
[0004]近年来,PRRSV的流行越来越复杂,建立一 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测PRRSV的RT
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RAA荧光型引物和探针,包括RAA
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ORF7引物对和RAA
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ORF7探针,其特征在于,所述RAA
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ORF7引物对的正向引物核苷酸序列为:5'
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ATGCCAAATAACAACGGCAAGC
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3',反向引物核苷酸序列为:5'
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GCAAACTAAACTCCACAGTGTAACTTAT
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3',扩增长度为扩增产物长度为292bp;所述RAA
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ORF7探针为,5'CAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGC(TexRd)G(THF)G(BHQ2)AAGATCATCGCC
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C3 Spacerr
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3'。2.一种检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂,其特征在于,所述的RT
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RAA扩增试剂包括权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂,其特征在于:所述RT
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RAA扩增试剂还包括A Buffer、B Buffer和DEPC处理水。4.根据权利要求2
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3任一项所述的检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于:包括RT
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RAA扩增方法,S1、扩增体系50μl:A Buffer 25μl、正向引物(10μM)2.0μl、反向引物(10μM)2.0μl、探针(10μM)0.6μl、DNA/RNA样本和DEPC处理水17.9μl、B Buffer 2.5μl;S2、加样操作:先将A Buffer、上下游引物、探针和DEPC处理水先加入反应干粉Mix,再加入样本震荡混匀,最后在盖上加入B Buffer、与反应管震荡混匀并离心10s,放入荧光定量PCR仪中进行扩增;S3、扩增条件:荧光定量PCR仪预热42℃、40s循环1次,扩增42℃、30s循环40次,采集荧光信号,获得扩增曲线。5.根据权利要求4所述的检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于,还包括通过所述扩增曲线进行检测结果判定:阳性样本:有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤15min或Ct值≤30时,为有效结果;阴性样本:无扩增曲线出现,或出峰时间≥20min或Ct值≥40时,为有效结果;检测样本:有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤18min或Ct值≤36时为阳性,出峰时间>18min或Ct值>36时为阴性。6.根据权利要求5所述的检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于,还包括构建阳性质粒,所述阳性质粒的构建方法包括:A1、RNA提取A1.1、将PRRSV XH
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GD株、CH
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1a株、GM2株分别接种Marc
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145细胞,25cm2细胞培养瓶培养,72h后加入胰酶消化细胞并收集细胞悬液作为样本,使用通用RNA提取试剂盒提取待测样本基因组;A1.2、将细胞连同培养液一起转移至1.5ml无菌无酶离心管中,1000
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g离心5min,弃上清,多次收集得到所需的细胞数;A1.3、加入400μl RLB,颠倒混匀,25℃或室温静置5min。A1.4、加入200μl的无水乙醇,颠倒混匀均匀,此时溶液中可能有核酸析出;A1.5将RNA吸附柱置于收集管中,将上述溶液(含其中的核酸沉淀)全部转移到RNA吸附柱中,8000rpm离心30s,弃滤液;A1.6、向RNA吸附柱中加入BWB1400μl,8000rpm离心30s,弃滤液;
A1...
【专利技术属性】
技术研发人员:曹宗喜,马佳镁,刘光亮,陈素贞,张艳,黄春媛,范悦轩,郑佳馨,
申请(专利权)人:海南省农业科学院三亚研究院海南省实验动物研究中心,
类型:发明
国别省市:
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