一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT-RAA荧光型检测方法技术

技术编号:37591193 阅读:16 留言:0更新日期:2023-05-18 11:25
本发明专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT

RAA荧光型检测方法


[0001]本专利技术涉及了猪繁殖与呼吸综合征检测
,具体的是一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT

RAA荧光型检测方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是威胁全球养猪业发展的最重要主要疾病之一。PRRSV感染各年龄段的猪,但妊娠母猪和仔猪的临床表现最严重。妊娠母猪感染PRRSV部分会导致流产,胎儿部分自溶和木乃伊胎,而感染PRRSV的幼猪会出现发烧、严重呼吸困难、厌食、嗜睡、眼皮水肿,耳朵或臀部的出现蓝色等典型临床特征。到目前为止HP

PRRSV样和NADC30样毒株仍是主要的野生流行毒株,临床检出率较高。
[0003]PRRSV属套式病毒目,动脉炎病毒科,它与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EVA)、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)和猴出血热病毒(Simian hemmorrhagic fevervieus,SHFV)同属动脉炎病毒属。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。它的基因组大小约为15.4kb,5

和3

端分别有非编码区,包含至少10个开放阅读框(ORF)。
[0004]近年来,PRRSV的流行越来越复杂,建立一个快速检测方法为PRRSV的早期防控尤为重要。
[0005]RAA检测技术是基于重组酶介导链置换核酸扩增技术开发的恒温核酸扩增技术,RNA在逆转录酶作用下反转成cDNA,DNA/cDNA能够在短时间内(5

20min)扩增109‑
10
12
倍,扩增产物所带的荧光基团释放荧光信号,可结合荧光定量PCR仪检测荧光信号,根据扩增产物的浓度及荧光信号强度显示出不同程度的扩增曲线,且检测样本的扩增曲线在15min内起峰且Ct值在36内均判断为阳性,出峰时间超过18min或Ct值超过36为阴性。RAA恒温扩增技术在各行业已成为热点,荧光定量PCR仪也在食品安全监测、人畜病害防治、植物病害诊断等领域广泛应用,许多猪养殖场也配备了荧光定量PCR仪。
[0006]PRRSV ORF7区域在全病毒基因组中属于高度稳定区,极少出现突变,因此在PRRSV ORF7区域建立一种更加简单、便捷的检测PRRSV的方法,通过与其他检测方法比较,RAA方法具有临床操作便捷、适宜养殖场快速检测使用等特点,适合生猪养殖场推广使用,为PRRSV临床快检检测提供更加高效的途径。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术中的至少部分缺陷,本专利技术本专利技术根据PRRSV研究进展及对PRRSV公开序列进行序列比对及分析,基于PRRSV ORF7序列设计一组正反向引物及探针,构建一种基于PRRSV ORF7的RT

RAA荧光型检测方法。
[0008]本专利技术涉及的一种用于检测PRRSV的RAA

ORF7型引物和探针,包括RAA

ORF7引物对和RAA

ORF7探针,所述RAA

ORF7引物对的正向引物核苷酸序列为:5'

ATGCCAAATAACAACGGCAAGC

3',反向引物核苷酸序列为:5'

GCAAACTAAACTCCACAGTGTAACTTAT

3';
[0009]所述RAA

ORF7探针为,
[0010]5'CAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGC(TexRd)G(THF)G(BHQ2)AAGATCATCGCC

C3 Spacerr

3',扩增长度为扩增产物长度为292bp。
[0011]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂,所述的RT

RAA扩增试剂包括上述引物和探针。
[0012]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂,还包括A Buffer、BBuffer和水。
[0013]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于:包括RT

RAA扩增方法,
[0014]S1、扩增体系50μl:A Buffer 25μl、正向引物(10μM)2.0μl、反向引物(10μM)2.0μl、探针(10μM)0.6μl、RNA样本和水17.9μl、BBuffer 2.5μl;
[0015]S2、加样操作:先将A Buffer、上反向引物、探针和水先加入反应干粉Mix,再加入样本震荡混匀,最后在盖上加入B Buffer、与反应管震荡混匀并离心10s,放入荧光定量PCR仪中进行扩增;
[0016]S3、扩增条件:荧光定量PCR仪预热42℃、40s循环1次,扩增42℃、30s循环40次,采集荧光信号,获得扩增曲线。
[0017]进一步地,还包括通过所述扩增曲线进行检测结果判定:
[0018]阳性样本:有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤15min(Ct值≤30),为有效结果;
[0019]阴性样本:无扩增曲线出现,或出峰时间≥20min(Ct值≥40),为有效结果;检测样本:
[0020]有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤18min(Ct值≤36)时为阳性,出峰时间>18min(Ct值>36)时为阴性。
[0021]进一步地,还包括构建阳性质粒,所述阳性质粒的构建方法包括:
[0022]A1、RNA提取:
[0023]A1.1、PRRSV(XH

GD株、CH

1a株、GM2株)分别接种Marc

145细胞,25cm2细胞培养瓶培养,72h后加入胰酶消化细胞并收集细胞悬液作为样本,使用通用RNA提取试剂盒提取待测样本基因组;
[0024]A1.2、将细胞连同培养液一起转移至1.5ml离心管中,1000
×
g离心5min,弃上清,多次收集得到所需的细胞数;
[0025]A1.3、加入400μl RLB,颠倒混匀,25℃或室温静置5min。
[0026]A1.4、加入200μl的无水乙醇,颠倒混匀均匀,此时溶液中可能有核酸析出;
[0027]A1.5将RNA吸附柱置于收集管中,将上述溶液(含其中的核酸沉淀)全部转移到RNA吸附柱中,8000rpm离心30s,弃滤液;
[0028]A1.6、向RNA吸附柱中加入BWB1400μl,8000rpm离心30s,弃滤液;
[002本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PRRSV的RT

RAA荧光型引物和探针,包括RAA

ORF7引物对和RAA

ORF7探针,其特征在于,所述RAA

ORF7引物对的正向引物核苷酸序列为:5'

ATGCCAAATAACAACGGCAAGC

3',反向引物核苷酸序列为:5'

GCAAACTAAACTCCACAGTGTAACTTAT

3',扩增长度为扩增产物长度为292bp;所述RAA

ORF7探针为,5'CAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGC(TexRd)G(THF)G(BHQ2)AAGATCATCGCC

C3 Spacerr

3'。2.一种检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂,其特征在于,所述的RT

RAA扩增试剂包括权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂,其特征在于:所述RT

RAA扩增试剂还包括A Buffer、B Buffer和DEPC处理水。4.根据权利要求2

3任一项所述的检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于:包括RT

RAA扩增方法,S1、扩增体系50μl:A Buffer 25μl、正向引物(10μM)2.0μl、反向引物(10μM)2.0μl、探针(10μM)0.6μl、DNA/RNA样本和DEPC处理水17.9μl、B Buffer 2.5μl;S2、加样操作:先将A Buffer、上下游引物、探针和DEPC处理水先加入反应干粉Mix,再加入样本震荡混匀,最后在盖上加入B Buffer、与反应管震荡混匀并离心10s,放入荧光定量PCR仪中进行扩增;S3、扩增条件:荧光定量PCR仪预热42℃、40s循环1次,扩增42℃、30s循环40次,采集荧光信号,获得扩增曲线。5.根据权利要求4所述的检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于,还包括通过所述扩增曲线进行检测结果判定:阳性样本:有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤15min或Ct值≤30时,为有效结果;阴性样本:无扩增曲线出现,或出峰时间≥20min或Ct值≥40时,为有效结果;检测样本:有典型的扩增曲线出现,出峰时间≤18min或Ct值≤36时为阳性,出峰时间>18min或Ct值>36时为阴性。6.根据权利要求5所述的检测PRRSV的RT

RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用,其特征在于,还包括构建阳性质粒,所述阳性质粒的构建方法包括:A1、RNA提取A1.1、将PRRSV XH

GD株、CH

1a株、GM2株分别接种Marc

145细胞,25cm2细胞培养瓶培养,72h后加入胰酶消化细胞并收集细胞悬液作为样本,使用通用RNA提取试剂盒提取待测样本基因组;A1.2、将细胞连同培养液一起转移至1.5ml无菌无酶离心管中,1000
×
g离心5min,弃上清,多次收集得到所需的细胞数;A1.3、加入400μl RLB,颠倒混匀,25℃或室温静置5min。A1.4、加入200μl的无水乙醇,颠倒混匀均匀,此时溶液中可能有核酸析出;A1.5将RNA吸附柱置于收集管中,将上述溶液(含其中的核酸沉淀)全部转移到RNA吸附柱中,8000rpm离心30s,弃滤液;A1.6、向RNA吸附柱中加入BWB1400μl,8000rpm离心30s,弃滤液;
A1...

【专利技术属性】
技术研发人员:曹宗喜马佳镁刘光亮陈素贞张艳黄春媛范悦轩郑佳馨
申请(专利权)人:海南省农业科学院三亚研究院海南省实验动物研究中心
类型:发明
国别省市:

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