鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物学技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括用于检测山羊痘病毒属的通用PCR扩增引物、用于检测羊痘病毒的探针和用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针，可以用于对山羊痘病毒属中的羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒直接进行定性鉴别检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的优点，还可以实现准确定量的目的。本发明专利技术可以为山羊痘病毒属病毒的鉴别区分、流行病学调查、病毒防控，疫苗原料的净化与筛选等提供技术支持与帮助。与筛选等提供技术支持与帮助。与筛选等提供技术支持与帮助。

【技术实现步骤摘要】
鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒及其专用引物和探针


[0001]本专利技术属于生物学
，具体涉及一种鉴别羊痘病毒(包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒)和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒及其专用引物和探针，以及鉴别区分羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的非疾病诊断方法。

技术介绍

[0002]山羊痘病毒属(Capripox virus)属于痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科，该属包括山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛结节性皮肤病病毒(LSDV)，该属病毒为DNA病毒，基因组全长约150kb，编码147个开放阅读框。
[0003]山羊痘病毒引发的疾病症状主要是皮肤丘疹
‑
脓包型痘疹。山羊痘病毒可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率达100％，主要通过接触破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播从而感染其他山羊，同群间传播迅速。绵羊痘，又名绵羊天花是由绵羊痘病毒引起的一种接触性传染病，其他的特征是在全身皮和粘膜上发生特异的痘疹。不同品种、性别、年龄的绵羊均易感，病羊发热并有较高的死亡率。牛结节皮肤病是由牛结节皮肤病病毒引起的以患牛发热，皮肤黏膜、器官表面广泛性结节为特征的急性、亚急性或慢性传染病。病牛体表淋巴结肿大，泌乳牛可发生乳房炎，公牛睾丸炎造成永久或暂时性不育等，严重时导致动物死亡。以上三种山羊痘病毒属病毒给奶牛和肉牛养殖业造成了严重的经济损失。
[0004]疫苗预防是防控病毒的主要手段，虽然山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒间存在一定的交叉保护性，可以利用山羊痘疫苗作为牛结节皮肤病的预防措施，但是针对性的疫苗预防将会带来更好的防控效果。然而，山羊痘病毒属成员间基因组序列差异较小，这增加了对山羊痘病毒属成员的鉴别难度，例如对羊痘病毒(包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒)与牛结节性皮肤病病毒之间的鉴别难度。目前虽然已有鉴别山羊痘病毒属成员的方法，例如专利文献CN112126717A(以下称文献1)公开一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒，但是该文献1公开的方法并不能直接对羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒进行鉴别检测。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒，所述羊痘病毒包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒，所述检测试剂盒包括：
[0006]用于检测山羊痘病毒属的通用PCR扩增引物组，该通用PCR扩增引物组包括SEQ ID NO:1所示的正向引物LSD13F和SEQ ID NO:2所示的反向引物LSD13R；
[0007]用于检测羊痘病毒的探针GaPvP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和
[0008]用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSDVP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0009]在一些实施方式中，所述探针GaPvP和探针LSDVP的5
’
端标记有不同的荧光报告基团，3
’
端均标记有荧光淬灭基团。
[0010]在一些实施方式中，所述检测试剂盒还包括标准品：CDS17标准品和CDS21标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒进行单引物双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。
[0011]本专利技术另一方面提供一种用于检测山羊痘病毒属的通用PCR扩增引物，其用于上述的检测试剂盒中，包括SEQ ID NO：1所示的正向引物LSD13F和SEQ ID NO:2所示的反向引物LSD13R。
[0012]本专利技术另一方面提供一种用于检测羊痘病毒的探针GaPvP，其用于上述的检测试剂盒中，该探针GaPvP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0013]本专利技术另一方面提供一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSDVP，其用于上述的检测试剂盒中，该探针LSDVP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0014]本专利技术又一方面提供一种鉴别区分羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：
[0015]S1：提取待测样品的DNA；
[0016]S2：以步骤S1提取的DNA为模板，用上述提及的试剂盒中的通用PCR扩增引物组、探针GaPvP和探针LSDVP进行单引物双重荧光PCR扩增，获得扩增曲线；
[0017]S3：对步骤S2获得的扩增曲线进行分析，判定待测样品中是否含有羊痘病毒和/或牛结节性皮肤病病毒；
[0018]判定标准为：
[0019]若探针GaPvP对应的荧光通道出现扩增曲线，且Ct值≤38，则判定为所述待测样品中含有羊痘病毒；若Ct值>40，则判定为阴性，即所述待测样品中不含有羊痘病毒；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40，则判定为所述待测样品中含有羊痘病毒；若无扩增曲线或再次检测的Ct值>40，则判定为所述待测样品中不含有羊痘病毒；
[0020]若探针LSDVP对应的荧光通道出现扩增曲线，且Ct值≤38，则判定为所述待测样品中含有牛结节性皮肤病病毒；若Ct值>40，则判定为阴性，即所述待测样品中不含有牛结节性皮肤病病毒；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40，则判定为所述待测样品中含有牛结节性皮肤病病毒；若无扩增曲线或再次检测的Ct值>40，则判定为所述待测样品中不含有牛结节性皮肤病病毒。
[0021]在一些实施方式中，步骤S2中进行双重荧光PCR扩增的25～30μL体系包含：正向引物LSD13F(10μM)0.25～0.75μL、反向引物LSD13R(10μM)0.25～0.75μL、探针GaPvP(10μM)0.50～1.00μL、探针LSDVP(10μM)0.50～1.00μL、DNA模板1～3μL、qPCR Mix10～15μL、ddH2O补足25～30μL。
[0022]在一些实施方式中，步骤S2中进行双重荧光PCR扩增的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性10～15s，55℃退火延伸30～34s，循环40
‑
45次。
[0023]在一些实施方式中，所述探针GaPvP的5
’
端标记的荧光报告基团为VIC，3
’
端标记
的淬灭基团为MGB；所述探针LSDVP的5
’
端标记的荧光报告基团为FAM，3
’
端标记的淬灭基团为MGB；所述判定标准为：
[0024]若VIC荧光通道出现扩增曲线，且Ct值≤38，则判定为所述待测样品中含有羊痘病毒；若本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的单引物双重荧光检测试剂盒，所述羊痘病毒包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒，所述检测试剂盒包括：用于检测山羊痘病毒属的通用PCR扩增引物组，该通用PCR扩增引物组包括SEQ ID NO:1所示的正向引物LSD13F和SEQ ID NO:2所示的反向引物LSD13R；用于检测羊痘病毒的探针GaPvP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSDVP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述探针GaPvP和探针LSDVP的5
’
端标记有不同的荧光报告基团，3
’
端均标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其还包括标准品：CDS17标准品和CDS21标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒进行单引物双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。4.一种用于检测山羊痘病毒属的通用PCR扩增引物，其用于权利要求1
‑
3中任一项所述的检测试剂盒中，包括SEQ ID NO：1所示的正向引物LSD13F和SEQ ID NO:2所示的反向引物LSD13R。5.一种用于检测羊痘病毒的探针GaPvP，其用于权利要求1
‑
3中任一项所述的检测试剂盒中，该探针GaPvP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。6.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSDVP，其用于权利要求1
‑
3中任一项所述的检测试剂盒中，该探针LSDVP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。7.一种鉴别区分羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的非疾病诊断方法，其包括以下步骤：S1：提取待测样品的DNA；S2：以步骤S1提取的DNA为模板，用权利要求1
‑
3中任一项提及的试剂盒中的通用PCR扩增引物组、探针GaPvP和探针LSDVP进行单引物双重荧光PCR扩增，获得扩增曲线；S3：对步骤S2获得的扩增曲线进行分析，判定待测样品中是否含有羊痘病毒和/或牛结节性皮肤病病毒；判定标准为：若探针GaPvP对应的荧光通道出现扩增曲线，且Ct值≤38，则判定为所述待测样品中含有羊痘病毒；若Ct值>...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，辛俊利，黄海碧，宋庆庆，赵丽霞，刘玉梅，刘建奇，刘东霞，张彦婷，范文霞，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：