一种用于非洲猪瘟病毒检测的等温扩增-光电化学传感一体化器件的制备方法及用途技术

本发明专利技术属于猪传染性病毒检测领域，公开了一种用于非洲猪瘟病毒ASFV检测的等温扩增

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒检测的等温扩增
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光电化学传感一体化器件的制备方法及用途


[0001]本专利技术属于猪传染性病毒检测领域，主要涉及一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)检测的环介导等温扩增
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光电化学传感一体化器件的制备方法及用途。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒ASFV感染引起的高度接触传染性疾病，感染家猪和各种野猪的死亡率可高达100％，该病给世界各国的养猪业和生态系统造成了巨大的经济损失。自2007年以来，非洲猪瘟已在世界许多国家和地区发生、传播和蔓延。2018年首次在我国报道,给我国养猪业造成灾难性的打击，我国将该病列为一类动物疫病。因此对ASFV的快速灵敏检测至关重要。ASFV是一种大型双链DNA病毒，编码150
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200个蛋白。其中p54蛋白是ASFV病毒基因E183L的产物，位于病毒内囊膜，是病毒主要结构蛋白之一，在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时起着十分重要的作用，这些特性使得p54蛋白成为ASFV诊断的靶点之一。目前已经建立了多种ASFV的分子生物学检测方法，如聚合酶链反应(PCR)、实时PCR、数字PCR等，这些方法均需要专业的技术人员和特定的仪器设备，成本较高，限制了其在现场快速的检测应用，从而导致这些技术无法实现对ASFV传染初期进行快速防控。因此，建立一种快速、灵敏的ASFV检测方法，对实现ASFV的早期检测和快速防控，减少养猪业的损失具有重要的价值。
[0003]光电化学(PEC)检测是一种新型的电化学检测技术，是基于光电活性物质的光
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电转换信号来确定对检测物的定量分析。检测过程包括光活性材料吸收光子，以产生足够的电子
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空穴对；随后光激发产生的载流子转移到电极产生电信号，到电解质溶液中参与氧化还原反应实现能量的转换。PEC检测具有背景信号干扰低、响应速度快、灵敏度高、设备简单等优点，这让它能够在众多的检测方法中脱颖而出。因此，将PEC技术和特异性识别的生物元件(适配体、抗体和核酸等)相结合，可以实现对病毒的特异性检测。而环介导等温扩增(LAMP)作为一种替代PCR的等温检测方法，不需要热循环设备调节温度来进行复杂的温度变化过程，且具有更高的扩增效率和特异性，可以实现简单、快速、准确的基因检测。
[0004]在本专利技术中，将LAMP的优点和PEC的优异性能结合，采用LAMP实现核酸靶标信号放大，利用PEC检测作为信号输出平台，提出了一种基于原位LAMP
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PEC传感一体化器件及其制备方法实现成本低、工艺简单，快速检测ASFV的目的，为核酸诊断提供了一种简单、经济、高效的方法，同时也提供了一种将LAMP与电化学结合构建新型生物传感检测的新思路，目前还未见相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在将LAMP的信号放大和电化学传感结合使用，提供一种集快速、简单、低成本等优点为一体的基于LAMP策略PEC生物传感的ASFV灵敏检测。通过制备铋/次碳酸铋Bi/(BiO)2CO3光电活性材料以提供光电信号，在引物一端修饰氨基，通过醛胺缩合反应固定
在电极表面进行后续的原位LAMP，并采用电化学工作站检测光电流变化以实现对ASFV的检测。将LAMP与电化学技术相结合，以构建进一步应用的等温扩增
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光电化学传感一体化器件。
[0006]本专利技术中用于非洲猪瘟病毒检测的等温扩增
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光电化学传感一体化器件的制备方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1、制备光催化材料次碳酸铋(BiO)2CO3：
[0008]将氨水溶液和去离子水混合，得到稀释的溶液A；在搅拌条件下，将柠檬酸铋加入溶液A中，形成清澈的溶液B。然后，将无水碳酸钠溶于去离子水中得到溶液C；将溶液C逐滴加入溶液B中形成白色沉淀，继续搅拌反应，离心收集产物，用去离子水和乙醇分别洗涤离心，空气干燥得到固体产物(BiO)2CO3；
[0009]步骤2、构建微型池：
[0010]丝网印刷碳电极SPCE表面设有中心电极区域和外围非电极区域；电极区域包含一个碳工作电极(直径3mm)、一个碳辅助电极和一个Ag/AgCl参比电极；在SPCE的非电极区域覆盖一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜(厚度3
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5mm)，形成微型池；
[0011]步骤3、制备修饰电极：
[0012]将步骤1中得到的(BiO)2CO3分散于水中，得到(BiO)2CO3分散液，将(BiO)2CO3分散液滴涂在步骤2中SPCE的电极区域中碳工作电极上，置于红外灯下烘干，得到(BiO)2CO3/SPCE电极；在(BiO)2CO3/SPCE电极上在硝酸铋溶液中电沉积铋纳米粒子(Bi)，制到Bi修饰的(BiO)2CO3/SPCE电极，即Bi/(BiO)2CO3/SPCE；
[0013]步骤4、光电化学生物传感的构建：
[0014]在Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极上滴涂壳聚糖(CHIT)溶液，置于红外灯下烘干。接着，将戊二醛(GA)溶液滴于电极表面，并置于室温下反应，反应完毕后，用PBS淋洗，除去电极表面多余的GA。将正向内引物NH2‑
FIP溶液滴在Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极表面，反应一段时间后，用PBS淋洗以除去过量的未结合的NH2‑
FIP，最终得到带有引物的电极NH2‑
FIP/Bi/(BiO)2CO3/SPCE；
[0015]步骤5、ASFV的原位LAMP：
[0016]将反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、ASFV标准样品与核酸扩增反应液混合均匀得到溶液D，将溶液D滴于步骤4中制备好的NH2‑
FIP/Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极表面，然后将电极置于加热器孵育一段时间后，得到用氨基(NH2‑
)连接的扩增产物(dsDNA)，制得dsDNA/Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极，构成用于非洲猪瘟病毒检测的LAMP
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PEC传感一体化器件。,并测量其光电流值，将光电流值与ASFV标准样品浓度的对数值做标准曲线。
[0017]步骤1中，
[0018]氨水溶液的质量浓度为28.0％，
[0019]溶液B中，氨水溶液、去离子水和柠檬酸铋的用量比为2mL：13mL：0.8g；
[0020]溶液C中，无水碳酸钠和去离子水的用量比为3.2g：15mL；
[0021]溶液C和溶液B的体积比1:1；
[0022]搅拌时间为2小时；
[0023]步骤3中，
[0024](BiO)2CO3分散液的浓度为2mg/mL，(BiO)2CO3分散液滴加的量为5μL；
[0025]硝酸铋溶液由12.5g硝酸铋溶于100mL浓硝酸中，再加去离子水定容到250mL制得；电沉积时间为40秒；
[0026]步骤4中，
[0027]所述CHIT的质量百分浓度为0.1％，滴加量为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于非洲猪瘟病毒检测的等温扩增
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光电化学传感一体化器件的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、制备光催化材料次碳酸铋(BiO)2CO3：将氨水溶液和去离子水混合，得到稀释的溶液A；在搅拌条件下，将柠檬酸铋加入溶液A中，形成清澈的溶液B；将无水碳酸钠溶于去离子水中得到溶液C；将溶液C逐滴加入溶液B中形成白色沉淀，继续搅拌反应，离心收集产物，用去离子水和乙醇分别洗涤离心，空气干燥得到固体产物(BiO)2CO3；步骤2、构建微型池：丝网印刷碳电极SPCE表面设有中心电极区域和外围非电极区域；电极区域包含一个碳工作电极、一个碳辅助电极和一个Ag/AgCl参比电极；在SPCE的非电极区域覆盖一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜，形成微型池；步骤3、制备修饰电极：将步骤1中得到的(BiO)2CO3分散于水中，得到(BiO)2CO3分散液，将(BiO)2CO3分散液滴涂在步骤2中SPCE的电极区域中碳工作电极上，置于红外灯下烘干，得到(BiO)2CO3/SPCE电极；在(BiO)2CO3/SPCE电极上在硝酸铋溶液中电沉积铋纳米粒子Bi，制到Bi修饰的(BiO)2CO3/SPCE电极，即Bi/(BiO)2CO3/SPCE；步骤4、光电化学生物传感的构建：在Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极上滴涂壳聚糖CHIT溶液，置于红外灯下烘干，接着，将戊二醛GA溶液滴于电极表面，并置于室温下反应，反应完毕后，用PBS淋洗，除去电极表面多余的GA；将正向内引物NH2‑
FIP溶液滴在Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极表面，反应一段时间后，用PBS淋洗以除去过量的未结合的NH2‑
FIP，最终得到带有引物的电极NH2‑
FIP/Bi/(BiO)2CO3/SPCE；步骤5、ASFV的原位LAMP：将反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、ASFV标准样品与核酸扩增反应液混合均匀得到溶液D，将溶液D滴于步骤4中制备好的NH2‑
FIP/Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极表面，然后将电极置于加热器孵育一段时间后，制得dsDNA/Bi/(BiO)2CO3/SPCE电极，构成用于非洲猪瘟病毒检测的等温扩增
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光电化学传感一体化器件,并测量其光电流值，将光电流值与ASFV标准样品浓度的对数值做标准曲线。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，氨水溶液的质量浓度为28.0％，溶液B中，氨水溶液、去离子水和柠檬酸铋的用量比为2mL：13mL：0.8g；溶液C中，无水碳酸钠和去离子水的用量比为3.2g：15mL；溶液C和溶液B的体积比1:1；搅拌时间为2小时。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，碳工作电极的直径为3mm，聚二甲基硅氧烷PDMS膜的厚度为3
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5mm。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3中，(BiO)2CO3分散液的浓度为2mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王坤，袁瑞霜，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：