一种基于MSRE-qPCR检测HIV-1启动子甲基化的方法技术

本发明专利技术建立了一种基于甲基化敏感性限制性内切酶－定量PCR(methylation

【技术实现步骤摘要】
一种基于MSRE
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qPCR检测HIV
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1启动子甲基化的方法


[0001]本专利技术主要涉及定量检测HIV
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1启动子甲基化的技术
技术背景
[0002]人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)属于慢病毒亚家族，感染机体后具有长潜伏期和慢性持续感染的特点。病毒整合到受感染的CD4+细胞的基因组中，并在细胞亚群中保持转录沉默状态，这一过程称为病毒潜伏期，潜伏感染的细胞提供了一个维持病毒感染的储存库，这种特性使得从治疗上针对病毒并根除感染变得极其困难。虽然，高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)的使用已经大大降低了HIV相关疾病的发病率、死亡率和传播，但是这种治疗方法最显著的局限性是无法消除感染者体内的的储存库，这种储存库在终身治疗下持续存在。研究发现HIV
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1的潜伏感染与表观遗传学调控有关，其中HIV
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1启动子区域5'
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LTR的CpG岛的甲基化水平影响着病毒基因表达。如果启动子区的CpG岛中胞嘧啶被甲基化，就会导致非常稳定的转录沉默，去甲基化剂可以诱导HIV
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1转录的激活。因此，本专利技术主要是针对HIV
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1启动子区域建立更为高效、可靠的甲基化检测方法。
[0003]传统的DNA甲基化分析主要是基于亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶对亚硫酸氢盐有抗性，并保持不变。通过此种处理可以区分甲基化DNA和非甲基化DNA之间的差异，随后进行甲基化特异性PCR、DNA测序或联合亚硫酸氢盐限制性检测。基于这些技术的可靠性和准确性，它们被广泛用于定量位点特异性DNA甲基化。然而，这些检测需要复杂的过程，例如克隆和测序，这限制了它们在高通量分析中的使用。
[0004]HpaⅡ敏感性分析是结合甲基化敏感性限制性内切酶与实时定量PCR(methylation
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sensitive restriction enzymes
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based quantitative PCR,MSRE
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qPCR)的实验方法，定量检测HIV
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1启动子甲基化。经典的甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ识别并切开未甲基化的CCGG序列，当CCGG序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HpaII酶切被阻断。因此基于这一甲基化敏感限制性内切酶，采用定量PCR的方法，针对HIV
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1启动子包含CCGG区域设计扩增引物，定量检测HIV
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1启动子的甲基化程度。本方法能够有效量化被感染细胞中HIV
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1启动子甲基化的程度，为探索病毒甲基化调控的分子机制，筛选潜在的甲基化调节药物，提供技术支持，而且此方法容易操作，耗时短，且相关性好，可在一定程度上缩短实验时间，节省人力、物力。

技术实现思路

[0005]为了解决现有的技术问题，本专利技术提供了一种更简单易操作的定量检测HIV
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1启动子甲基化的方法。
[0006]为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种定量检测HIV
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1启动子甲基化的方法，包括以下步骤：
[0007]1)提取HIV
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1病毒感染细胞的总DNA；
[0008]2)使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ对提取的DNA酶切；
[0009]3)酶切产物纯化回收；
[0010]4)设计引物，以纯化后的DNA为模板，进行qPCR定量检测HIV
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1启动子甲基化水平；
[0011]5)根据Ct值计算HpaⅡ敏感性，评价样品中HIV
‑
1启动子甲基化水平。
[0012]其中步骤1)提取DNA时要确保DNA的浓度和纯度。
[0013]其中步骤2)酶切体系根据实际需要确定，通常酶切体系为30μl。将以下溶液充分混匀，37℃孵育3h。
[0014][0015]其中步骤3)使用乙醇沉淀的方法对酶切产物做纯化回收。
[0016]其中步骤4)设计HIV
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1启动子5'
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LTR序列的扩增引物，同时设计内参基因GAPDH的引物，引物序列如下：
[0017]5’‑
LTR:forward
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GCCAATGAAGGAGAGAACAACA
[0018]reverse
‑
AGCGGAAAGTCCCTTGTA
[0019]GAPDH:forward
‑
GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC
[0020]reverse
‑
CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT
[0021]其中，步骤5)对qPCR结果采用公式[1
–
2Ct(mock)
–
Ct(HpaII)]×
100％进行计算,得到HpaII的敏感性，以百分数表示，即HpaII的敏感性为100％，代表HIV
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1启动子没有发生甲基化；HpaII的敏感性为0％，代表HIV
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1启动子完全甲基化。
[0022]本专利技术的创新在于：
[0023]本专利技术在甲基化敏感限制性内切酶的基础上，采用quantitative real
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time PCR的方法，针对HIV
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1启动子5'LTR设计扩增引物，定量检测HIV
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1启动子的甲基化程度，此方法容易操作，耗时短，且相关性好，可在一定程度上缩短实验时间，节省人力、物力。
附图说明
[0024]图1HIV
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1启动子5'
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LTR区域示意图；
[0025]图2甲基化质粒和未甲基化质粒HpaⅡ敏感性鉴定；
[0026]图3HpaⅡ敏感性检测方法效果评价。
具体实施方式
[0027]以下实例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0028]实施例1HIV
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1启动子5'
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LTR序列含有2个HpaII酶切位点，易被甲基化(图1)。因此，构建含有HIV
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1启动子5'
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LTR序列的真核表达质粒：pLTR
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EGFP，并在体外进行甲基化修饰，得到甲基化质粒：pmeLTR
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EGFP。经HpaII酶切后，采用qPCR分别定量检测pLTR
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EGFP与
pmeLTR
‑
EGFP质粒中5'
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LTR的CpG甲基化水平，采用公式[1
–2Ct(mock)
–
Ct(HpaII)<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于甲基化敏感性限制性内切酶－定量PCR(methylation
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sensitive restriction enzymes
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based quantitative PCR,MSRE
‑
qPCR)检测HIV
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1启动子甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取HIV
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1病毒感染的细胞的总DNA；2)使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ对提取的DNA酶切；3)酶切产物纯化回收；4)设计引物，以纯化后的DNA为模板，进行qPCR定量检测HIV
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1启动子甲基化水平；5)根据Ct值计算HpaⅡ敏感性，评价样品中HIV
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1启动子甲基化水平。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)提取DNA时要确保DNA的浓度和纯度。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓霞，李媛媛，贾怀杰，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：