检测禽I群腺病毒的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开检测禽I群腺病毒的引物探针组合及其应用。本发明专利技术首先公开了用于检测禽I群腺病毒的引物探针组合物，包括特异性加尾引物对、通用引物对和双标记探针，序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
检测禽I群腺病毒的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术涉及动物检疫领域。更具体地，涉及一种用于检测禽I群腺病毒的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒(Fowl adenoviruses,FAdVs)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为3个群，即I群、II群和III群。其中禽II群腺病毒为火鸡出血性肠炎的病原，禽III群腺病毒为蛋减产综合征病原。而禽I群腺病毒相对复杂，目前认为包含5个种(A、B、C、D和E)，根据交叉中和试验可划分为12个血清型，根据六邻体基因序列可分为12个基因型。其中部分毒株可引起禽类的包涵体肝炎、心包积水综合征、肌胃腐蚀症、腱鞘炎、胰腺坏死以及鹌鹑的支气管炎等，特别是当本群病原与鸡传染性贫血病毒(CIAV)或传染性法氏囊病病毒(IBDV)发生合并感染时，可加重其病情。禽I群腺病毒感染世界各地均有报道，呈地方流行特征，感染宿主包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽、珠鸡以及鸵鸟等，可造成鸡和火鸡产蛋下降，幼禽生长缓慢，饲料报酬降低以及雏禽死亡率增加等危害。
[0003]禽I群腺病毒感染可通过病理剖解和组织病理学检查核内包涵体进行初步诊断，确诊可采用电镜直接观察病毒粒子形态以及病毒分离鉴定等方法进行，但这些方法均存在操作繁琐、检测周期长和检出率低的问题。已报道的核酸检测方法包括常规PCR方法和基于荧光染料的实时荧光定量PCR方法，这些方法一般针对六邻体基因的不同区域或者52K基因进行设计，由于缺乏特异性探针，因此在结果判定常受到非特异性扩增的影响，常常难以通过电泳结果或熔解曲线准确判定结果。由于禽I群腺病毒毒株型复杂，目前尚未有快速、灵敏的针对所有株型的禽I群腺病毒的通用实时荧光定量PCR检测方法。

技术实现思路

[0004]针对目前的上述问题，本专利技术的一个目的在于提供用于检测禽I群腺病毒的引物探针组合物、试剂盒及其应用。
[0005]本专利技术的另一个目的是提供利用上述引物探针组合物或试剂盒检测禽I群腺病毒的方法，该方法灵敏、特异，不仅适用于进出口禽类粪便、全血及病变组织中禽I群腺病毒的进境风险监测，也可用于国内禽类养殖企业大批量样品中禽I群腺病毒的快速筛查。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了用于检测禽I群腺病毒的引物探针组合物，所述组合物包括特异性加尾引物对、通用引物对和双标记探针；
[0008]所述特异性加尾引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
[0009]SEQ ID NO.1：5
’‑
AACTTCCACGACCACATGGCKCAGATGGCYAAGG
‑3’
，(正义引物)；
[0010]SEQ ID NO.2：5
’‑
GAGCACGGTATCCACGCGCCTGGGTCAAACCGA
‑3’
，(反义引物)；
[0011]所述通用引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：
[0012]SEQ ID NO.3：5
’‑
TT+CCAC+GAC+CAC
‑3’
，(正义引物)；
[0013]SEQ ID NO.4：5
’‑
CAC+GGTAT+C+CAC
‑3’
，(反义引物)；
[0014]其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸；
[0015]所述双标记探针为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列：
[0016]SEQ ID NO.5：5
’‑
ATTCCGCAGATGACTGACGCCGAGTAC
‑3’
，(探针1)；
[0017]SEQ ID NO.6：5
’‑
ATCCCTCAGATGTCTGACGCGGACTAC
‑3’
，(探针2)。
[0018]进一步，所述双标记TaqMan探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0019]根据本专利技术的具体实施方式，所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的双标记TaqMan探针的5
’
端标记的荧光报告基团为FAM，3
’
端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
[0020]第二方面，本专利技术提供了上述引物探针组合物在制备检测禽I群腺病毒的试剂或试剂盒中的应用。
[0021]第三方面，本专利技术提供了一种用于检测禽I群腺病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述检测禽I群腺病毒的引物探针组合物。
[0022]进一步，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应所需试剂，例如荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照、水等中的至少一种，所述荧光定量PCR反应液可包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、BSA和Taq DNA聚合酶等。
[0023]进一步，所述阴性对照可为鸡肉组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成5％悬液。
[0024]进一步，所述阳性对照可为含有目的扩增基因的质粒DNA；
[0025]例如将SEQ ID NO.7所示的为920bp的禽I群腺病毒52K基因的片段克隆于pBluescript II SK+载体Sac II/Not I位点获得，即pBSK
‑
Fade
‑1‑
GROUP
‑
920。
[0026]本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物和TaqMan探针进行单独包装的步骤。
[0027]第四方面，本专利技术提供了检测禽I群腺病毒的方法(TaqMan探针荧光定量PCR检测法)包括如下步骤：
[0028]1)提取待测样品中的DNA；
[0029]2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述的引物探针组合物或试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应；
[0030]3)结果判断。
[0031]进一步，所述荧光定量PCR扩增反应中，所述特异性加尾引物对、通用引物对和双标记探针的摩尔比为4:2:1。
[0032]进一步，PCR扩增体系为25μL体系，反应条件为：95℃/3min；95℃/15s，58℃/35s，42个循环；荧光收集设于58℃退火延伸阶段。
[0033]本专利技术的有益效果如下：
[0034]本专利技术以禽I群腺病毒52K基因作为靶区域，设计复合引物(含特异性加尾引物和通用引物)及双TaqMan探针建立并优化可检测禽I群腺病毒的检测方法，取得了优异的技术效果：1)快速：该方法与目前使用基于凝胶电泳的普通PCR方法和基于染料方法的实时荧光定量PCR方法相比，不需要电泳或熔解曲线测定，因此速度更快。2)更为灵敏：检测方法灵敏度比单纯使用一对引物更为灵敏；对系列稀释的质粒DNA进行检测，使用概率回归分析。结
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测禽I群腺病毒的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包括特异性加尾引物对、通用引物对和双标记探针；所述特异性加尾引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.1：5
’‑
AACTTCCACGACCACATGGCKCAGATGGCYAAGG
‑3’
；SEQ ID NO.2：5
’‑
GAGCACGGTATCCACGCGCCTGGGTCAAACCGA
‑3’
；所述通用引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.3：5
’‑
TT+CCAC+GAC+CAC
‑3’
；SEQ ID NO.4：5
’‑
CAC+GGTAT+C+CAC
‑3’
；其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸；所述双标记探针为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.5：5
’‑
ATTCCGCAGATGACTGACGCCGAGTAC
‑3’
；SEQ ID NO.6：5
’‑
ATCCCTCAGATGTCTGACGCGGACTAC
‑3’
。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述双标记探针的5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪琳，高志强，蒲静，张小寒，白子龙，杜思乐，赵相鹏，张伟，尹羿，任彤，张佳玮，赖平安，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：