检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，具体涉及检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法。本发明专利技术提供的引物对RPA

【技术实现步骤摘要】
检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。猕猴桃褪绿环斑病毒(Actinidia chlorotic ringspot
‑
associated virus，AcCRaV)是一种特异性侵染猕猴桃的病毒，该病毒在猕猴桃产区普遍发生，且通常和其它病毒复合侵染。猕猴桃在感染AcCRaV时，常表现出叶片褪绿、斑驳和环斑等症状，严重影响猕猴桃的产量和品质。
[0003]果树病毒的检测是病毒病害预测、预报及防治的关键环节。目前报道的AcCRaV检测方法主要是逆转录PCR(Reverse transcription
‑
PCR，RT
‑
PCR)，该检测方法需要经过样品采集，研磨，RNA提取，反转录，PCR，电泳等过程，且需配置PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪等专业设备，过程相对繁琐且费钱费时费工；此外，由于RT
‑
PCR的灵敏度有限，在检测病毒含量较低的材料时容易出现假阴性的结果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法，提高猕猴桃褪绿环斑病毒检测的灵敏性、特异性和检测速度。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种利用RPA检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R。
[0007]本专利技术还提供了一种利用RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物组，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F、序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R和序列为SEQ ID NO.3所示的探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe。
[0008]优选的，所述探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe中的Y被[THF]替换，所述探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe的5
’
端添加FITC标记，3
’
端添加聚合酶扩增阻断基团。
[0009]本专利技术还提供了一种利用RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的检测试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组、反应缓冲液和阳性对照。
[0010]优选的，还包括逆转录试剂、核酸提取试剂和RNase抑制剂。
[0011]本专利技术还提供了一种基于RT
‑
RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的方法，包括如下步骤：
[0012]提取含有猕猴桃褪绿环斑病毒的待测样品的总RNA；
[0013]利用上述技术方案所述引物组对总RNA进行RT
‑
RPA反应，得RPA产物；
[0014]利用测流层析试纸条对所述RPA产物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑病毒。
[0015]优选的，进行所述RT
‑
RPA反应时，以50μL的总体系计，在干粉反应管中加入150～600nM上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F，150～600nM下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R，50～150nM探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe，29.5μL Primer Free Rehydration buffer，1μL总RNA，1μL M
‑
MLV逆转录酶，1.4μL RNase Inhibitor，2.5μL 280mM醋酸镁和余量的RNase
‑
free H2O；
[0016]所述干粉反应管中含有重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。
[0017]优选的，所述RT
‑
RPA反应的温度为35～40℃，反应的时间为10～30min。
[0018]优选的，所述判断的方法包括：将所述RPA产物滴加至测流层析试纸条的样品应用区后，将试纸条垂直插入分析缓冲液MGCBB中，孵育5～15min，取出试纸条读取结果，若在试纸条上的质控线和检测线处均出现紫红色的线，则判定为阳性样品；若在试纸条上只有质控线处出现紫红色的线，则判定为阴性样品。
[0019]优选的，所述分析缓冲液MGCBB包括柠檬酸磷酸盐缓冲液。
[0020]本专利技术提供了一种利用RPA检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R。本专利技术根据AcCRaV外壳蛋白基因序列的保守区域设计RPA引物对及nfo探针，能够扩增猕猴桃褪绿环斑病毒的基因组RNA，特异性好，实现猕猴桃褪绿环斑病毒的检测。
[0021]本专利技术将利用RPA检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对与nfo探针结合使用，得到检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物组，能直接对猕猴桃褪绿环斑病毒进行RT
‑
RPA
‑
LFD检测，检测时间短，结果可用肉眼判读，更加方便，实现了对待检样品的快速检测，并且灵敏度高，特异性好，最低检测限为10
‑8ng/μL。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023]图1为本专利技术上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F、下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R和探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe在猕猴桃褪绿环斑病毒(AcCRaV)外壳蛋白基因中的位置示意图，其中黑色下划线部分为引物所在位置，紫色方框部分为探针所在位置；
[0024]图2为实施例3利用RT
‑
RPA技术检测AcCRaV的结果图；
[0025]图3为实施例3利用RT
‑
RPA
‑
LFD技术检测AcC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用RPA检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对，其特征在于，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R。2.一种利用RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物组，其特征在于，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
F、序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA
‑
AcCRaV
‑
R和序列为SEQ ID NO.3所示的探针Ac CRaV
‑
nfo
‑
probe。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe中的Y被[THF]替换，所述探针AcCRaV
‑
nfo
‑
probe的5
’
端添加FITC标记，3
’
端添加聚合酶扩增阻断基团。4.一种利用RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的引物组、反应缓冲液和阳性对照。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括逆转录试剂、核酸提取试剂和RNase抑制剂。6.一种基于RT
‑
RPA
‑
LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取含有猕猴桃褪绿环斑病毒的待测样...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘占德，张阿玲，史遐，刘艳飞，余枫，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：