一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于四种血清型(I

【技术实现步骤摘要】
一种用于I
‑
IV型登革病毒检测的DENV
‑
crRNA及其试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于核酸检测领域，涉及一种用于四种血清型(I
‑Ⅳ
型)登革病毒(DENV)检测的DENV
‑
crRNA及其试剂盒和应用，具体涉及一种基于CRISPR技术检测I
‑Ⅳ
型登革病毒DENV
‑
crRNA(CRISPR RNA)及其试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]登革热是由登革病毒(DENV)引起的一种严重的全球性流行的虫媒传染病，主要分布在热带、亚热带地区，最主要的传播媒介是埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Ae.albopictus)。登革病毒根据抗原不同分为4种血清型(I～IV型)，每种血清型均可引起登革热症状。对血清或白纹伊蚊进行登革病毒的精准检测，对疾病的诊断与流行研判及预警等均具有重要意义。
[0003]登革病毒的常见检测方法有：病毒分离培养、反转录聚合酶链式反应、血清学方法如中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等，杂交技术与基因芯片技术等也可用来测定登革病毒。
[0004]但是以上方法存在一定限制，如病毒分离培养方法培养周期长，利用PCR技术、血清学方法的诊断过程耗时，需要熟练、专业的操作人员以及特殊的仪器设备等，难以满足传染病防控中的快速侦检与预警需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于I
‑Ⅳ
型登革病毒检测的DENV
‑
crRNA。
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒。
[0007]本专利技术的最后一个目的在于提供上述用于I
‑Ⅳ
型登革病毒检测的DENV
‑
crRNA或试剂盒在制备I
‑Ⅳ
型登革病毒检测产品中的应用。
[0008]本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于I
‑Ⅳ
型登革病毒检测的DENV
‑
crRNA，所述DENV
‑
crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]DENV
‑
crRNA的序列具体如下：
[0010]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUAUGCUGAAACGCGCGAGAAA(如SEQ ID NO：1所示)。
[0011]本专利技术中用于检测I
‑Ⅳ
型登革病毒DENV的DENV
‑
crRNA，包括与Cas蛋白结合的序列和与待测核酸杂交的登革病毒DENV特异性导向序列。
[0012]本专利技术所述DENV
‑
crRNA，其DENV特异性导向序列含有23个碱基(见序列中的划线部分)，特异性筛选自I
‑Ⅳ
型DENV基因组序列，用于特异性靶向识别来源于I
‑Ⅳ
型DENV核酸扩增产物的待测核酸序列。
[0013]本专利技术的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒，包括上述DENV
‑
crRNA。
[0014]进一步的，所述试剂盒还包括Cas12a蛋白、待测核酸和单链核酸检测器。
[0015]本专利技术所述Cas蛋白是指CRISPR
‑
associated蛋白，当其与待检测特征序列(靶序列)结合，形成Cas蛋白
‑
crRNA
‑
靶序列的三元复合物时，能诱发其附带切割活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(单链核酸检测器)。
[0016]优选的，本专利技术中Cas蛋白选自V型Cas蛋白，为Cas12家族中Cas12a，更优选为LbCas12a。
[0017]本专利技术待测核酸从待测样品中扩增获得，如采用特异性DENV引物对待测样品进行核酸扩增获得待测核酸。
[0018]其中待测样品主要为病人血清样品等，也可以是来自昆虫如埃及伊蚊和/或白纹伊蚊的组织研磨液等。
[0019]优选的，本专利技术核酸扩增选择重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)，并提供扩增
Ⅰ‑Ⅳ
型登革病毒(DENV)核酸序列的特异性引物对。
[0020]其余可用于本专利技术的核酸扩增方法还有聚合酶链式反应(PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)等。
[0021]优选的，本专利技术所述待测核酸为登革病毒特异性的RT
‑
RAA扩增产物，所述RT
‑
RAA扩增产物采用登革病毒特异性RAA引物扩增获得，所述RAA引物为引物对D1、引物对D2、引物对D3或引物对D4，分别用于扩增四种血清型(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ或Ⅳ型)登革病毒(DENV)，每对引物均包括上游引物和下游引物，其中所述引物对D1的上游引物如SEQ ID NO：2所示，所述引物对D1的下游引物如SEQ ID NO：3所示，所述引物对D2的上游引物如SEQ ID NO：4所示，所述引物对D2的下游引物如SEQ ID NO：5所示，所述引物对D3的上游引物如SEQ ID NO：6所示，所述引物对D3的下游引物如SEQ ID NO：7所示，所述引物对D4的上游引物如SEQ ID NO：8所示，所述引物对D4的下游引物如SEQ ID NO：9所示。
[0022]具体的：从5'
‑
3'，引物对D1
‑
引物对D4如下：
[0023]引物对D1上游引物(D1
‑
dsDNA
‑
44F)：
[0024]AAGCTTGCTTAACGTAGTTCTRACAGTTTTT(SEQ ID NO：2所示)；
[0025]引物对D1下游引物(D1
‑
dsDNA
‑
263R)：
[0026]GRAATCTTAGGAATGCTATRAAAGCCATCAC(SEQ ID NO：3所示)；
[0027]引物对D2上游引物(D2
‑
dsDNA
‑
88F)：
[0028]AGATCTCTGATGAATAACCAACGGRAAAAG(SEQ ID NO：4所示)；
[0029]引物对D2下游引物(D2
‑
dsDNA
‑
344R)：
[0030]CCTTCCAATCTCTTTCCTGAACCCTCTCAA(SEQ ID NO：5所示)；
[0031]引物对D3上游引物(D3
‑
dsDNA
‑
88F)：
[0032]AGATCTCTGATGAACAACCAACGGAARAAG(SEQ ID NO：6所示)；
[0033]引物对D3下游引物(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于I
‑Ⅳ
型登革病毒检测的DENV
‑
crRNA，其特征是：所述DENV
‑
crRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述DENV
‑
crRNA。3.根据权利要求2所述的基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒，其特征是：还包括Cas12a蛋白、待测核酸和单链核酸检测器。4.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒，其特征是：所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。5.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I
‑Ⅳ
型登革病毒的试剂盒，其特征是：所述待测核酸为登革病毒的RT
‑
RAA特异性扩增产物，所述RT
‑
RAA特异性扩增产物采用登革病毒的RAA特异性引物扩增获得，所述RAA特异性引物为引物对D1、引物对D2、引物对D3或引物对D4，分别用于扩增四种血清型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ或Ⅳ型登革病毒，每对引物均包括上游引物和下游引物，其中所述引物对D1的上游引物如SEQ ID NO：2所示，所述引物对D1的下游引物如SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏玲，郭祥，任文雯，李紫瑶，周晓红，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：