一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。该引物组合包括外引物对、内引物对以及环形引物对，主要是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因、牛副流感病毒3型c基因型的N基因、牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因/A型hyaC

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用


[0001]本专利技术属于病原检测生物
，涉及一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。

技术介绍

[0002]环境因素的改变、自身免疫力的下降或病原体的感染等多种原因均可能导致疾病的发生。随着我国进出口贸易和养牛业的快速发展，牛繁育规模化程度的显著提高，加上牛不断被调入转出，牛系统性疾病发生的危害性不仅日益严重，且更加复杂，以多种病毒、细菌混合感染为常见，而牛呼吸系统疾病是养牛业常见的疾病之一。呼吸系统疾病在世界范围内严重流行，病死率平均在10％左右，高达40％。引发牛呼吸系统疾病的病原主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型基因a和c型(BPIV
‑
3a and BPIV
‑
3c)、牛支原体(Mycoplasma bovis，M.b)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)等。
[0003]IBR呈世界性流行，在我国奶牛平均阳性率35.8％，甚至高达70％。BPIV多见于集约化饲养的奶牛和肉牛，呈亚临床感染；支原体、IBRV混合感染可加剧病情。支原体感染形成的牛呼吸道疾病死亡率高达50％以上，病情多发生于犊牛长途运输过程中。美国成牛的BRSV感染总发生率高达67％；加拿大牛养殖中BRSV感染的总发生率约为36％；瑞典牛奶中BRSV抗体出率最高可达到89％，而犊牛感染呼吸道合胞体病毒的概率相对较高，超过90％。牛多杀性巴氏杆菌感染，在流行期达98％以上，尤其犊牛在长途运输、突换饲料、气候骤变等情况下极易感染多杀性巴氏杆菌而发病。
[0004]鉴于牛呼吸系统疾病通常是多病原混合感染，多种病原的同时检测有利于快速获得诊断结果，以便于及早制定有效的预防与治疗措施。
[0005]病原分离是鉴定的金标准，但操作繁琐、耗时长、技术要求高和分离率低，对人员和实验条件要求高，同时还需要借助于血清学、生化鉴定，甚至分子生物学技术才能确定，是其缺点；血清学诊断方法虽然已被普遍使用，但是由于抗体产生速度较为缓慢，不适于在病原急性感染或早期感染阶段的使用。常规PCR方法的扩增结果需要借助于凝胶电泳的目的片段大小及序列测定分析来判断，灵敏度较低，耗时较长，较繁琐。多重实时荧光定量PCR虽然可实现同时检测多病原，也体现高特异性与高敏感性，快速、检测效率高的特点，但存在升温、变温等过程，耗时相对较长，对仪器多通道要求较高。荧光环介导恒温扩增LAMP具有灵敏度高、特异性好、反应时间短，各被检测病原的引物之间没有相互干扰，又集合荧光定量PCR的优点，通过溶解曲线和Tm值实现结果的判定，更有利于推广应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种同时检测牛呼吸系统疾病五种主要病毒和细菌荧光环介导恒温扩增技术的引物组合，用于检测源于牛呼吸系统疾病临床或亚临床样本中的牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型和c基因型、牛支原体、牛多杀
性巴氏杆菌A型和B型，及早发现病原，并对相关病原进行分型，有助于临床治疗、疫苗使用等防控措施的有效制定。
[0007]上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]用于检测牛呼吸系统疾病的五种病原的LAMP引物组合，可特异地扩增牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型，BPIV
‑
3a与BPIV
‑
3c)N基因、牛支原体(M.b)的oppD/F、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)的ompH基因，以及对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行区分检测的hyaC
‑
hyaD和bcbD基因，因此，该引物组合不仅可用于上述五种病原体的检测，也可对BPIV 3型和牛多杀性巴氏杆菌进行基因型和血清亚型的区分。
[0009]所述引物组合包括以上每种病原的外引物F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，具体引物核苷酸序列如下：
[0010]⑴
IBRV的gB基因
[0011]表1
[0012]引物序列编号序列F3SEQ ID No.1TGGGCATGGGCGAGATB3SEQ ID No.2GTGCCCGTGCGGTAGAFIPSEQ ID No.3AAGGCCACCACCTTGCGCCCACGGACCTGGTGGACABIPSEQ ID No.4CTGAAGCCTGCGCGGCTGAGCGCCGTGTACACATCGTCLFSEQ ID No.5GCGCAGGTACTCGGCTTTCG
[0013]⑵
BRSV的N基因
[0014]表2
[0015][0016]⑶
BPIV
‑
3a和BPIV
‑
3c N基因
[0017]表3
[0018][0019]表4
[0020][0021][0022]⑷
M.b的oppD/F
[0023]表5
[0024][0025]⑸
Pm.b的引物组合信息
[0026]①
ompH基因
[0027]表6
[0028][0029]②
A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC
‑
hyaD引物组
[0030]表7
[0031][0032][0033]③
B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域引物组
[0034]表8
[0035]经优选，所述的引物组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。
[0036]本专利技术的目的之二在于提供上述用于检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基
因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型的N基因(BPIV
‑
3a、BPIV
‑
3c)、牛支原体(M.b)的oppD/F、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)的ompH/A型的hyaC
‑
hyaD/B型的bcbD区域的引物组合物及应用，用荧光环介导恒温扩增方法以扩增上述几种病原微生物的特异基因，不仅可鉴别检测五种病原。
[0037]经优选，所述的引物组合物在荧光环介导恒温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4
‑
10：4
‑
10：4
‑
8：4
‑
8。
[0038]经优选，所述的环介导恒温扩增反应条件为62
‑
65℃，50
‑
60min。
[0039]经优选，在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒基因、牛合胞体病毒基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)基因、牛支原体基因、牛多杀性巴氏杆菌基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛呼吸系统疾病的五种病原体牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(BPIV 3a和BPIV 3c)的N基因、牛支原体(M.b)的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌(P.m)的ompH、A型的hyaC
‑
hyaD、B型的bcbD基因的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括内引物对F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，其中
⑴
IBRV的gB基因表1
⑵
BRSV的N基因表2表2
⑶
BPIV
‑
3a和BPIV
‑
3c N基因表3
表4
⑷
M.b的oppD/F表5表5
⑸
Pm.b的引物组合
①
ompH基因表6
②
A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC
‑
hyaD引物组表7hyaD引物组表7
③
B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域引物组表82.如权利要求1所述用于检测牛呼吸系统五种病原体IBRV、BRSV、BPIV 3a、BPIV3c、M.b、P.m特异基因的LAMP引物组合，其特征在于，IBRV：所述引物组合是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因保守区设计；
BRSV：所述引物组合是针对牛合胞体病毒的N基因保守区设计；BPIV 3a和BPIV3c：所述引物组合是针对牛副流感病毒3型的N基因保守区设计；M.b：所述引物组合是针对牛支原体的oppD/F基因保守区设计；P.m(A、B血清型)：所述引物组合是针对牛多杀性巴氏杆菌ompH基因保守区设计，可判断是否是P.m；针对A型的荚膜hyaC

【专利技术属性】
技术研发人员：张莅宸，
申请(专利权)人：北京芯之悦生物技术中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：