可同时检测ASFV、PEDV和FMDV的引物和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪口蹄疫病毒(FMDV)的引物和探针组合及其应用，其中包括分别针对ASFV P72基因、PEDV N基因及FMDV 3D基因的三组引物和探针；进一步还包括针对β

【技术实现步骤摘要】
可同时检测ASFV、PEDV和FMDV的引物和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和兽医学领域，尤其涉及诊断非洲猪瘟、猪流行性腹泻和猪口蹄疫三种高发病原(ASFV、PEDV和FMDV)的多重荧光定量引物和探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)和猪口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是长期制约养猪业发展的三种重大疾病。其中ASF和FMD被OIE(Office International des Epizooties)列为A类传染病，PED为B类传染病。ASF和PED具有高致病率和高死亡率，FMD虽不具有高死亡率，但一旦发生要求全群捕杀。因此ASF、PED和FMD对养猪业的发展是毁灭性的，需各养殖集团加强三种病原的日常监控。
[0003]ASF是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种猪广泛出血性、接触性传染病，致死率达100％。ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)是目前已知的唯一虫媒DNA病毒(Dixon LK,Chapman DA,Netherton CL,Upton C.African swine fever virus replication and genomics.Virus Res.2013 Apr；173(1):3<br/>‑
14.)。ASFV粒子直径约200 nm，基因组全长约170 kb～193 kb，可编码50余种结构蛋白和100多种非结构蛋白。p220、p54、p62、pE248R、p72、CD2v和p49等是病毒粒子中重要的结构蛋白，其中p72蛋白是最主要的结构蛋白，也是临床检测及分型的靶基因，根据P72基因的可变区序列可将ASF分为24种基因型(Farlow J,Donduashvili M,Kokhreidze M,Kotorashvili A,Vepkhvadze NG,Kotaria N,Gulbani A.Intra
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epidemic genome variation in highly pathogenic African swine fever virus(ASFV)from the country of Georgia.Virol J.2018Dec 14；15(1):190.)。ASF我国主要流行基因II型，占比约90％，但随着人流、物流的扩散，I型毒株有逐步传播的趋势并且出现了自然变异株、MGF和CD2V单基因或多基因低毒力毒株。在ASF无有效疫苗的情况下，ASF不断变异及多种基因型共同流行给病原诊断带来了更严峻的挑战，因此建立行之有效的疾病预警、监测及清除体系必不可少。
[0004]PED是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和脱水为典型的临床症状。PEDV属于套式病毒目(Nidovvirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α
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冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员。病毒粒子多数趋于球形，大小介于95nm～190nm之间，具有囊膜，囊膜上是由核心向外呈放射状排列的棒状纤突，纤突长为18nm～23nm，是线性、单股、正链RNA病毒。PEDV基因组长约28kb，包括5'末端非编码区(5'UTR)和3'端非编码区(3'UTR)，至少含有7个开放阅读框，编码4种结构蛋白，膜蛋白(E)、纤突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)和三个非结构蛋白(复制酶1a和1b以及ORF3)(LEE,CHANGHEE 2016.Porcine epidemic diarrhea virus:An emerging and re
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emerging epizootic swine vir us[J].Virology Journal,13,1
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2.)，其中N蛋白是PEDV感染早期产生抗体最高也是最保守的的结构蛋白。PEDV于1971年在英国
首次被发现，之后在世界各地陆续报道，20世纪80年代初首次在我国报道有零星病例，随后逐渐在全国范围内蔓延，现今已经成为导致我国仔猪腹泻最主要的病原之一。虽然PEDV目前有成熟的商品化疫苗，但从一项数据，对2015～2021年662份粪便样品进行PED V检测，抗原检出率为42.9％，抗体合格率为58.7％，可看出疫苗效果无法达到100％(汪鸣.猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立[D].南京农业大学，2013.)，PEDV仍然形式严峻。
[0005]FMD是由口蹄疫病毒(Foot
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and
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Mouth Disease Virus，FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的一种烈性传染病，临床症状以体温升高、食欲不振、精神沉郁、跛行、流涎以及引发心肌炎、虎斑心和胃肠炎等为特征。FMDV属于小RNA病毒科、口疮病毒属。病毒粒子直径约为20～25 nm的无囊膜、单股线状、正链RNA病毒。FMDV基因组长约6.5 kb，由5
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非编码区(UTR)、一个开放阅读框(ORF)和一个poly(A)尾巴构成，编码多种蛋白，包括VP1、VP2、VP3、VP4和非结构蛋白NS。其中VP1是FMDV衣壳蛋白的主要抗原也是最易发生变异的蛋白，通过VP1序列的不同，可将FMDV分为不同的血清型，根据不同的血清型还可分为不同的亚型及不同的拓扑型。自1546年Girolamo Fraca storo首次发现FMDV以来，全球共计发现O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ7种血清型，其中O型和A型占主导地位，O型的危害最为严重(Kitur K,Park er D,Nieto P,et al.Toxin
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induced necroptosis is a major mechanism of Staphylococc us aureus lung damage[J].PLoS Pathog,2015,11(4):e1004820.)。FMD自1546年发现到至今已有400多年的历史，虽然有不同类型的商品化疫苗，但由于FMDV为RNA病毒及易发生变异且不同毒株间易发生重组，疫苗研发速度无法满足毒株变异速度，因此有效的防控FMDV仍然是全球面临的重大难题。
[0006]PEDV与FMDV均属于RNA病毒，ASFV属于DNA病毒，传统法对RNA病毒进行扩增时需将RNA反转录为cDNA，才可与DNA病毒同时进行扩增，其特异性、敏感性均受不同程度的限制，不能适应发生时的快速检测。以TaqMan探针为基础的多重实时荧光定量RT
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PCR作为一种快速、灵敏、特异的方法，可在一次本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.可检测ASFV、PEDV和FMDV病毒中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，包括：针对ASFV P72基因的引物对和探针，其引物对如序列1和序列2所示，探针如序列3所示；针对PEDV N基因的引物对和探针，其引物对如序列4和序列5所示，探针如序列6所示；针对FMDV 3D基因的引物对和探针，其引物对如序列5和序列6所示，探针如序列9所示。2.如权利要求1所述的可检测ASFV、PEDV和FMDV病毒中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，所述序列3的5
’
端用FAM修饰，3
’
端用BHQ1修饰，序列6的5
’
端用HEX修饰，3
’
端用BHQ1修饰，序列9的5
’
端用CY5修饰，3
’
端用BHQ3修饰。3.如权利要求2所述的可检测ASFV、PEDV和FMDV病毒中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，还包括针对β
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actin mRNA序列作为鉴别诊断ASFV/PEDV/FMDV病原的内标引物对和探针组合。4.如权利要求3所述的可检测ASFV、PEDV和FMDV病毒中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，所述针对β
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actin mRNA序列的引物对如序列10和序列11所示，针对β
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actin mRNA序列的探针如序列12所示，所述序列12的5
’
端用ROX修饰，3
’
端用BHQ2修饰。5.可检测ASFV、PEDV和FMDV病毒中至少一种的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，付能胜，王永强，
申请(专利权)人：泰州蕾灵百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：