一种检测HBVC区基因突变的引物组、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测HBVC区基因突变的引物组、方法及其应用，引物组的序列如SEQ ID NO.1～2所示，使用引物组配制反应体系，经过PCR扩增反应和测序PCR反应，再进行测序，获得HBVC区的突变信息。本发明专利技术优点包括：扩增总长度约为686bp，能有效覆盖C区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。度能够达到200copies/μL。度能够达到200copies/μL。

【技术实现步骤摘要】
一种检测HBV C区基因突变的引物组、方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种检测病毒突变的
，尤其检测HBV C区基因突变的技术。

技术介绍

[0002]HBV属嗜肝DNA病毒科，其基因组为部分环状双链DNA，约3200bp，包括4个开放读码框：前S/S区、前C/C区、X区以及P区，分别编码乙肝病毒包膜蛋白、E抗原(HBeAg)/核心蛋白(HBcAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。HBV具有高突变性，HBV变异后易造成免疫逃逸。
[0003]HBcAg被认为是CTL(细胞毒性T细胞)攻击的主要靶抗原。因此，C区基因序列的变化、HBcAg表达水平或HBcAg抗原决定簇结构改变都可能对HBV所致肝损害产生影响。C区基因会发生随机的错义变异，随着病情进展会出现错义变异的聚集，C区基因不同区域发生的聚集错义变异和严重肝损害密切相关。有些聚集错义变异区域与HBeAg C末端加工点有关。有研究表明C区基因变异与进展性肝病有关，C区基因变异聚集区出现氨基酸替换者都伴有进展性乙型肝炎疾病，变异聚集区未出现变异者其发展呈平静的过程，C区基因变异聚集区产生变异可作为疾病向差方向发展的一个指标。
[0004]另外C区基因突变中还存在耐药突变，不同的耐药突变会不同程度地影响不同药物的治疗效果。某些C区基因变异会影响对干扰素的应答，影响治疗效果。此外，C区还存在对其他药物产生耐药的一些基因变异。衣壳组装调节剂(capsid assembly modulators,CAMs)是一类有发展前景的治疗药物，JNJ
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56136379(JNJ
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6379)是一种有效的CAM。曾有研究针对JNJ
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6379的治疗效果与不同耐药突变的关系进行分析。该研究提及多个HBV核心蛋白氨基酸位置(如105、109、118等)与JNJ
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6379和/或其他CAMs的体外耐药相关。其中，2例JNJ
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6379治疗的患者具有Y118F基线多态性，具有对JNJ
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6379的体外耐药性；2例JNJ
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6379治疗的患者具有I105T基线多态性，不具有对JNJ
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6379的体外耐药性，但在一项1期研究中指出I105T基线多态性出现将AB
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506(CAM
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N)的体外活性降低19倍的情况，导致患者对AB
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506治疗缺乏反应；患者分别携带T109M(+I105L)和T109T/I基线多态性，在1期研究中，T109M替代将ABI
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H0731(CAM
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N)的体外活性降低了150倍，导致对ABI
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H0731的次优反应，而T109I替代将GLS4(CAM
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A)的体外活性降低了6.8倍。
[0005]一项能高效检测出HBV C区存在哪些基因突变的技术是具有极大临床价值的，能够为指导用药、制定治疗方案提高，利于预后向好的方向发展。然而现有的检测技术水平还是存在一些局限，例如会出现灵敏度不足等问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测HBV C区基因突变的引物组、方法及其应用，以解决现有技术中检测HBV C区基因突变技术灵敏度不足等问题。
[0007]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种检测HBV C区基因突变的引物组，包括PCR扩增引物，其序列如SEQ ID NO.1～2所示。
[0009]进一步地，还包括测序PCR引物，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]本专利技术还提供一种所述的检测HBV C区基因突变的引物组在制备试剂或试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术还提供一种包含所述引物组的测HBV C区基因突变试剂盒，包括PCR酶系、PCR反应液、Bigdye、Bigdye buffer、测序PCR引物。
[0012]进一步地，所述PCR酶系包括：热启动Taq酶2.5U；
[0013]所述PCR反应液包括：含Mg
2+
的10
×
Ace TaqBuffer，10mM dNTPs，扩增引物SEQ ID NO.1、扩增引物SEQ ID NO.2，H2O；
[0014]Bigdye；
[0015]Bigdye buffer；
[0016]测序PCR引物。
[0017]本专利技术还提供一种包含所述引物组的用于检测HBV C区基因突变的反应体系，包括PCR扩增体系和测序PCR反应体系，
[0018]PCR扩增体系成分包括：
[0019]待测核酸20μL；
[0020]PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
[0021]PCR反应液，其包括含Mg
2+
的10
×
Ace Taq Buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL、10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0022]测序PCR反应体系成分包括：
[0023]PCR产物XμL，X＝1
‑
2μL，若产物浓度低增至4
‑
5μL；
[0024]Bigdye 2μL；
[0025]Bigdye buffer 3μL；
[0026]3.2μM测序PCR引物1μL；
[0027]无菌水14
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XμL。
[0028]本专利技术还提供一种应用所述引物组检测HBV C区基因突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.1所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
[0029]更优地，所述PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，45个循环；72℃，7min；4℃，保温。
[0030]更优地，所述测序PCR扩增反应的程序为：96℃，1min；96℃，10s，50℃，5s，60℃，4min，25个循环；4℃，保温。
[0031]本专利技术的优点包括：针对HBV C区设计特异性引物，采用PCR扩增结合Sanger测序，检测HBV C区基因突变，扩增总长度约为686bp，能有效覆盖C区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。
附图说明
[0032]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0033]图1
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4是实施例一某阳性样本的部分测序峰图；
[0034]图5是实施例二的PCR扩增结果图；
[0035]图6是实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测HBV C区基因突变的引物组，其特征在于：包括PCR扩增引物，其序列如SEQ ID NO.1～2所示。2.根据权利要求1所述的一种检测HBV C区基因突变的引物组，其特征在于：还包括测序PCR引物，其序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种如权利要求1或2所述的检测HBV C区基因突变的引物组在制备试剂或试剂盒中的应用。4.一种包含权利要求2所述引物组的测HBV C区基因突变试剂盒，其特征在于：包括PCR酶系、PCR反应液、Bigdye、Bigdye buffer、测序PCR引物。5.根据权利要求4所述的一种包含所述引物组的检测HBV C区基因突变试剂盒，其特征在于：所述PCR酶系包括：热启动Taq酶2.5U；所述PCR反应液包括：含Mg
2+
的10
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Ace Taq Buffer，10mM dNTPs，扩增引物SEQ ID NO.1、扩增引物SEQ ID NO.2，H2O；Bigdye；Bigdye buffer；测序PCR引物。6.一种包含所述引物组的用于检测HBV C区基因突变的反应体系，其特征在于：包括PCR扩增体系和测序PCR反应体系，PCR扩增体系成分包括：待测核酸20μL；PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；PCR反应液，其包括含Mg
2+
的10
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Ace Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：李葆华，陈曦，甘小洪，刘菲，余治学，
申请(专利权)人：赛立安生物技术广州有限公司，
类型：发明
国别省市：