一种狼牙病毒核酸检测引物探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种狼牙病毒核酸检测引物探针、试剂盒及应用，涉及分子生物学领域；该引物和探针组合包括检测狼牙病毒的引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种狼牙病毒核酸检测引物探针、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种狼牙病毒核酸检测引物探针、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]亨尼帕病毒属是一种新兴的罕见人畜感染病毒，在生物安全上属于最危险的第四级(BSL4)，最为值得关注的是，这种病毒在家畜中的感染并传播到人，比如1998年尼帕病毒在猪群流行，并导致265人感染，其中105人死亡。2022年8月在某地发现了一种系统发育树上不一样的亨尼帕病毒，命名为Langya Virus。该毒株是从一名有动物接触史的发热患者咽拭子中分离得到，基因组由18402个核苷酸组成，其基因组结构与其他亨尼帕病毒相同。而在系统发育树上，发现该毒株属于新毒株，进化关系上，和在之前发现的亨尼帕病毒最相关。进一步调查发现，目前已经有35名急性Langya Virus感染者，其中26人仅感染了Langya Virus(没有其他病原体存在)。这26名患者出现发烧(100％的患者)、疲劳(54％)、咳嗽(50％)、厌食(50％)、肌痛(46％)、恶心(38％)、头痛(35％)和呕吐(35％)，伴有血小板减少(35％)、白细胞减少(54％)、肝(35％)和肾(8％)功能受损。
[0003]亨尼帕病毒属病例死亡率估计为40％至75％。根据当地流行病学监测和临床管理能力，这一比率可能随疫情而异。亨尼帕病毒可以通过动物(如蝙蝠或猪)或者被污染的食物传播给人类，也可以直接人传人。狐蝠科的果蝠是亨尼帕病毒的天然宿主。目前没有可用于人类或动物的疗法或疫苗。对人类的主要治疗是支持性护理。
[0004]现如今仍没有针对狼牙病毒的有效预防和治疗措施，为防范狼牙病毒的传播和感染，应建立特异性检测方法进行监测，做到提前预警。而亨尼帕病毒生物安全等级为四级，需要在P4实验室中进行分离培养，大部分实验室不具备这样的条件，荧光定量PCR无需分离活病毒适用于亨尼帕病毒等生物安全等级高的病毒检测，不容易发生生物安全事故，且简单、快速、灵敏。目前荧光RT
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PCR及多重荧光RT
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PCR检测并无针对狼牙病毒的检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种狼牙病毒核酸检测引物探针、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒能够大大缩短操作时间，减少样品之间交叉污染，还具有准确性高、敏感性强、特异性好的特点，能够满足对未知样品中狼牙病毒的定性检测要求。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种用于狼牙病毒核酸检测的引物和探针组合，包括检测狼牙病毒的引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术还提供一种引物和探针组合在制备狼牙病毒核酸检测试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术还提供一种狼牙病毒核酸检测试剂盒，包括所述的引物和探针组合。
[0010]进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照以及内标引物对和内标探针。
[0011]进一步的，所述阳性对照为狼牙假病毒。
[0012]进一步的，所述内标引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4
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5所示，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]进一步的，所述内标为人体核糖核酸酶P保守区的部分核酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0014]进一步的，所述试剂盒的PCR反应程序为：50℃30min；95℃5min；95℃10sec，60℃30sec，45个循环。
[0015]本专利技术公开了以下技术效果：
[0016]本专利技术建立针对狼牙病毒(Langya Virus)的检测的方法，在NCBI上公布的狼牙病毒全基因序列中，设计一对保守基因序列的引物和探针，该区域保守度高不易发生突变。该方法具有快速、特异、敏感、可同时检测大量样品等优点。
[0017]本专利技术的方法在不同稀释度的模拟样品能够成功扩增出目标产物，使用阴性咽拭子样本对2.68
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107Copies/mL狼牙假病毒进行10倍稀释，提取核酸后，用荧光定量PCR仪进行检测，本专利技术的方法能够检测到2.68
×
102Copies/mL模拟样品中狼牙病毒。该方法变异系数CV≤5％，说明重复性和稳定性良好。具有准确性高、敏感性强、特异性好的特点，能够满足对未知样品中狼牙病毒的定性检测要求。本专利技术开发的一种针对狼牙病毒保守区域的RNA的荧光RT
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PCR检测方法，进一步将反应体系优化，只需将包含引物探针的反应预混液加入反应管，再加入样品核酸模板，即可进行PCR反应，大大缩短操作时间，减少样品之间交叉污染。总体检测时间(包含核酸提取)可在3h内完成。相比常规的染料法，本专利技术公开的荧光RT
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PCR方法中使用的荧光探针，具有高度特异性，反应结束后无需溶解曲线分析，且不易发生非特异性结合。本专利技术填补了国内检测狼牙病毒的空白。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为实施例1中试剂盒的基本生产工艺图；
[0020]图2为实施例2中不同样本浓度下试剂盒最低检测限试验重复三次扩增图，其中2.68
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101Copies/mL浓度的假病毒及阴性对照没有荧光信号增长，其他浓度均有荧光信号增长；
[0021]图3为实施例3中不同样本下试剂盒特异性试验重复三次扩增图，其中阳性对照和狼牙假病毒有扩增信号，其他假病毒无扩增信号。
具体实施方式
[0022]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0023]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每
个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0024]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0025]在不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于狼牙病毒核酸检测的引物和探针组合，其特征在于，包括检测狼牙病毒的引物对和探针；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种根据权利要求1所述的引物和探针组合在制备狼牙病毒核酸检测试剂盒中的应用。3.一种狼牙病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针组合。4.根据权利要求3所述的狼牙病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、内标、内标引物对和内标探针。5.根据权利要求4所述的狼牙病毒核酸检测试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雨峰，杨海侠，陈立柱，冯慧慧，付冰格，
申请(专利权)人：保定佳瑞源生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：