试剂盒和乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法技术

本发明专利技术具体提供一种试剂盒和乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法。所述试剂盒用于乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的检测；试剂盒包括数字PCR检测试剂，数字PCR检测试剂包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的型突变探针以及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生型探针；突变型探针和野生型探针的5

【技术实现步骤摘要】
试剂盒和乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法


[0001]本申请属于乙型肝炎病毒耐药突变检测
，尤其涉及一种试剂盒和乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B，简称：HBV)属嗜肝DNA病毒科，是最小的DNA病毒，主要感染肝脏。嗜肝DNA病毒分为正嗜肝病毒属和禽肝病毒属两个属，可以分别感染哺乳动物和禽类，感染人的是正嗜肝DNA病毒属。HBV可引起急性和慢性感染，病毒本身并不直接导致细胞病变，肝脏损伤通常是由宿主对病毒的免疫应答导致。慢性乙型病毒性肝炎(Hepatitis B virus；简称：CHB)如果没有有效的控制可能会导致肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等终末期肝病的发生。
[0003]目前CHB抗病毒的治疗方法可以让患者获益。临床主要有两类抗病毒药物：聚乙二醇干扰素(pegylated interferon；简称：PegIFNα)和NAs。PegIFNα有限疗程是1年通过活化细胞毒性T细胞靶向HBV感染的肝细胞裂解和细胞因子释放控制病毒的复制，PegIFNα治疗约25％的患者实现病毒抑制。NAs包括嘧啶核苷类药物：拉米夫定(LAM/3TC)和替比夫定商品名素比伏(LDT)、嘌呤核苷类药恩替卡韦商品名博路定(ETV)、嘌呤核苷酸类药阿德福韦酯商品名贺维力(ADV)和替诺福韦酯商品名韦瑞德(TDF)。NAs药物作用靶点都是HBV聚合酶逆转录过程，影响HBV的DNA合成，对HBV的RNA、HBeAg、HBsAg和HBcAg不直接影响。LAM、ADV和TDF具有显著的抗人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus；简写：HIV)活性。在母婴阻断时，对于高病毒载量的孕妇推荐使用LDT和TDF。NAs类药物不直接靶向cccDNA，所以感染的肝细胞中持续存在cccDNA是导致停药后的病毒学反弹和疾病复发的主要原因。所有CHB指南都推荐长期使用NAs抗病毒治疗，甚至终生服药。长期使用NAs药物除了对患者有依从性的考验也可能诱发耐药突变，比如由HBV第741位碱基G
→
T突变所引起的YIDD、第739位碱基A
→
G突变引起的YVDD等。及时进行耐药突变株检测有助于临床医师判断耐药发生并尽早调整治疗方案，巩固治疗成果。
[0004]目前一般采用包括聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction；简称：PCR)产物直接测序法、焦磷酸测序法、基因芯片法与线性探针反向杂交法等监测耐药突变，但是，这些监测方法在HBV DNA载量低时存在扩增困难以及在耐药发生早期耐药突变株占比低时容易漏检，尤其是PCR产物直接测序法和荧光PCR法需要突变达到20％以上时，才能检出。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的第一个目的在于提供一种试剂盒，以解决现有乙型肝炎病毒DNA低载量存在扩增困难以及YVDD耐药突变早期难以检出的问题。
[0006]本专利技术实施例采用的技术方案如下：
[0007]一种试剂盒，用于乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的检测；
[0008]所述试剂盒包括：
[0009]数字PCR检测试剂，所述数字PCR检测试剂包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的型突变探针以及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生型探针；所述突变型探针和所述野生型探针的5
’
端均标记有荧光基团、3
’
端均标记有淬灭基团。
[0010]相对于现有技术而言，本专利技术实施例提供的试剂盒，包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的型突变探针以及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生型探针，在用于对乙型肝炎病毒进行微滴数字PCR扩增时，可以实现乙型肝炎病毒DNA低载量的扩增，并且对YVDD耐药突变的检出限达到0.01％，可以实现对乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的早期筛查。
[0011]本专利技术实施例的第二个目的在于提供一种乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法，其采用的具体技术方案如下：
[0012]一种乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法，检测基于上述所述的试剂盒，包括以下步骤：
[0013]提取待测样本的DNA；
[0014]将所述数字PCR检测试剂和所述DNA混合，得到数字PCR反应体系；
[0015]将所述数字PCR反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，并加入缓冲液补齐，置于微滴制备器获得微滴；
[0016]将所述微滴转移至微孔板中进行PCR扩增反应；
[0017]将扩增结束的微孔板置于微滴读数器中进行读数中；
[0018]按照泊松分布原理自动计算获得所述数字PCR反应体系内乙型肝炎病毒中野生型DNA的拷贝数和突变型DNA的拷贝数。
[0019]优选地，所述PCR扩增反应的条件为：在95℃的条件下酶激活10min；在94℃的条件下变性30s，在55.7～56.9℃的条件下退火1min，循环40次；随后在98℃的条件下灭活10min，并在4℃的条件下保存。
[0020]相对于现有技术，本专利技术实施例提供的乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的数字PCR检测方法，在基于试剂盒成分的前提下，对乙型肝炎病毒植株野生型和突变型的检出限均可达到个位数拷贝每微升，可对野生型和突变型的占比分别进行计算，并且YVDD耐药突变的最低检出限可达0.01％，从而可以在早期及时发现患者YVDD的耐药突变。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1是本专利技术实施例中FAM
‑
MGB探针对野生质粒的退火温度探索图谱；
[0023]图2是本专利技术实施例中FAM
‑
MGB探针对突变质粒的退火温度探索图谱；
[0024]图3是本专利技术实施例中HEX3
‑
MGB探针对野生质粒的退火温度探索图谱；
[0025]图4是本专利技术实施例中HEX3
‑
MGB探针对突变质粒的退火温度探索图谱；
[0026]图5是本专利技术实施例中微滴数字PCR对野生型质粒进行精度检测的理论值和实际检测值柱状图；
[0027]图6是本专利技术实施例中微滴数字PCR对突变型质粒进行精度检测的理论值和实际值柱状图；
[0028]图7是本专利技术实施例中微滴数字PCR对同时包含野生型和突变型质粒进行精度检测的实际值柱状图；
[0029]图8是本专利技术实施例中患者G103本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于乙型肝炎病毒YVDD耐药突变的检测；所述试剂盒包括：数字PCR检测试剂，所述数字PCR检测试剂包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的型突变探针以及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生型探针；所述突变型探针和所述野生型探针的5
’
端均标记有荧光基团、3
’
端均标记有淬灭基团。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述突变型探针中5
’
端的荧光基团选自6
‑
FAM、3
’
端的淬灭基团选自MGB；所述野生型探针中5
’
端的荧光基团选自HEX、3
’
端的淬灭基团选自MGB。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR检测试剂还包括预混液，所述预混液含有DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、缓冲液以及水。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品、校准品、微孔板以及封膜。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖昊，曲久鑫，李小勇，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：