本发明专利技术公开了一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒。引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示，使用引物组配制PCR扩增体系和测序体系，经过PCR扩增反应和测序PCR反应，再进行测序，获得HBV前S/S区基因突变信息。本发明专利技术的优点有：采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，扩增产物能有效覆盖指南及文献报道的前S/S区热点突变位点，而且PCR扩增反应的灵敏度可以达到1000copies/μl。l。l。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒
[0001]本专利技术涉及检测HBV基因
，尤其涉及检测HBV前S/S区基因突变技术。
技术介绍
[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B)属嗜肝DNA病毒科，缩写为HBV。HBV基因的前S/S区负责编码乙肝病毒包膜蛋白。HBV基因的前S/S区包括前S1区、前S2区、S区。前S/S区编码的产物除了参与乙肝病毒装配，还具有免疫原性、反式激活剂的功能。HBV复制时存在逆转录行为，容易发生突变，持续感染HBV导致基因组突变累积，难免出现免疫逃避以及加重肝细胞损伤现象。
[0003]HBV前S/S区缺失突变可能与肝癌发生有关；HBV前S/S区的s118、s120、s126、s127、s129、s131、s133、s143、s144、s145位点突变与免疫逃避有关，可导致乙肝慢性化及肝病进展。HBV前S/S区突变检测对评估乙肝患者预后有一定价值，可用于联合评估肝病进展风险，拟定治疗方案及严格的随访策略，对防止或早期发现肝癌有一定临床价值。然而现有突变检测技术不能准确获悉上述突变相关信息，这对肝病预防、治疗等都造成了制约。因此研发一项HBV前S/S区突变检测技术，准确获悉HBV前S/S区突变信息是非常重要的。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒，以解决现有技术中不能准确提供HBV前S/S区基因突变信息的问题。
[0005]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
[0007]进一步地，还包括测序引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示。
[0008]本专利技术还提供一种所述的引物组在制备用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术还提供一种包含所述的引物组的用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂盒，包含：
[0010]PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
[0011]PCR反应液，其包括含Mg
2+
的PCRbuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物组；
[0012]Bigdye；
[0013]Bigdye buffer；
[0014]核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示的测序引物。
[0015]本专利技术还提供一种应用所述的引物组检测HBV前S/S区基因突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反
应，以SEQ ID NO.3～6所示的引物作为测序引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
[0016]本专利技术还提供一种包含所述的引物组的扩增体系，包括：
[0017]PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
[0018]PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0019]HBV样本核酸20μL。
[0020]本专利技术还提供一种应用所述的扩增体系的扩增方法，扩增程序为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温。
[0021]本专利技术还提供一种包含所述的引物组的扩增测序体系，PCR扩增体系包括：
[0022]PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
[0023]PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0024]HBV样本核酸20μL；
[0025]测序PCR体系包括：
[0026]PCR产物Xμl，X的取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值1
‑
2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值4
‑
5；
[0027]Bigdye 2μl；
[0028]Bigdye buffer 3μl；
[0029]测序引物1μl；
[0030]无菌水14
‑
Xμl；
[0031]测序引物如SEQ ID NO.3～6所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，配制4个测序PCR体系。
[0032]本专利技术还提供一种应用所述的扩增测序体系检测HBV前S/S区基因突变的方法，过程如下：
[0033](1)提取HBV核酸作为模板；
[0034](2)配制PCR扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温；
[0035](3)配制测序PCR体系，按如下程序进行测序PCR反应：96℃预变性1min；96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；4℃保温；
[0036](4)测序PCR产物纯化及Sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。
[0037]本专利技术的优点包括：针对HBV前S/S区基因，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前S区和S区基因突变，扩增总长度约为1400bp，包含前S1区108个氨基酸、前S2区55个氨基酸及S区226个氨基酸，能有效覆盖指南及文献报道的前S/S区热点突变位点，而且灵敏度可以达到1000copies/μl。
附图说明
[0038]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0039]图1
‑
4是某阳性样本的4个测序峰图的开头片段；
[0040]图5是实施例二的胶图；
[0041]图6是实施例三的胶图；
[0042]图7是实施例四的胶图。
具体实施方式
[0043]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，在此以本专利技术的示意性实施例及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0044]实施例一
[0045]1.实验材料
[0046]试剂：
[0047]核酸提取试剂(磁本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，其特征在于：包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，其特征在于：还包括测序引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示。3.一种如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂或试剂盒中的应用。4.一种包含如权利要求2所述的引物组的用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂盒，其特征在于：包含：PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；PCR反应液，其包括含Mg
2+
的PCRbuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物组；Bigdye；Bigdye buffer；核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示的测序引物。5.一种应用如权利要求2所述的引物组检测HBV前S/S区基因突变的方法，其特征在于：步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3～6所示的引物作为测序引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。6.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：包括：PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCR buffer 5μL，10mM dNTPs1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；HBV样本核酸20μL。7.一种应用如权利要求6所述的扩增体系的扩增方法，其特征在于：扩增程序为：95℃5分钟预变性；94...
【专利技术属性】
技术研发人员：李葆华，余治学，甘小洪，刘菲，陈曦，
申请(专利权)人：赛立安生物技术广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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