鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT-PCR引物探针组、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT

【技术实现步骤摘要】
鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，特别是涉及一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]赤羽病（Akabane disease）与施马伦贝格病(Schmallenberg disease)同属于布尼亚病毒病，分别是赤羽病病毒（Akabane virus, AKAV）和施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus,SBV）引起的虫媒传染病，主要引起牛羊等反刍动物繁殖障碍，包括流产、死胎、先天性畸形等症状，并且二者临床症状相似。SBV与AKAV同属布尼亚病毒中辛布血清群，二者存在血清交叉反应。
[0003]目前，AKAV或SBV的分子生物学诊断方法已有报道，但尚未有采用荧光RT
‑
PCR同时检测和鉴别AKAV和SBV的研究。建立一种快速筛查AKAV和SBV的双重荧光RT
‑
PCR检测技术，具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过双重荧光RT
‑
PCR反应，同时检测赤羽病病毒和施马伦贝格病毒。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组，包括：
[0007]鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物组，所述双重荧光RT
‑
PCR引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示；
[0008]鉴别赤羽病病毒的如SEQ ID NO：3所示的探针和鉴别施马伦贝格病毒的如SEQ ID NO：4所示的探针。
[0009]进一步地，所述探针5
’
端连接有荧光基团，3
’
端连接有淬灭基团，且SEQ ID NO：3所示的探针和SEQ ID NO：4所示的探针连接的荧光基团不同。
[0010]本专利技术还提供所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组在制备鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒产品中的应用。
[0011]本专利技术还提供一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的试剂盒，包含所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组。
[0012]本专利技术还提供一种非诊断目的的鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的方法，包括以下步骤：
[0013]以待测样本的RNA核酸为模板，利用所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组进行双重荧光RT
‑
PCR扩增，根据有无扩增曲线和Ct值，判断待测样本是否为赤羽病病毒和/或施马伦
贝格病毒。
[0014]进一步地，若有扩增曲线，且满足Ct≤38，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性；若有扩增曲线，且满足38＜Ct＜40，判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸可疑，重复检测若Ct＜40仍成立，则判定待测样本所含赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阳性，反之判定核酸阴性；若无扩增曲线，或者Ct>40，判定待测样本为赤羽病病毒或/且施马伦贝格病毒核酸阴性。
[0015]进一步地，所述双重荧光RT
‑
PCR扩增的反应体系包括以下组分：2X one
‑
step RT
‑
PCR buffer 10μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL，PrimeScript
TM RT Enzyme Mix 0.4μL，双重荧光RT
‑
PCR引物组各1.0μL，探针各0.5μL，RNA模板各3μL，加ddH2O补足至20μL。
[0016]进一步地，所述双重荧光RT
‑
PCR扩增的反应条件为：42℃，5min；95℃预变性2min；95℃5s；60℃30s，40个循环。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018]本专利技术为建立一种能够同时鉴别赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法，以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT
‑
PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时，评估其临床应用效果。结果显示，该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5copies/μL；与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应，具有良好的特异性；50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100％。本专利技术建立的双重荧光RT
‑
PCR方法，适用于AKAV和SBV的临床检测。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为AKAV和SBV双重荧光RT
‑
PCR方法标准曲线；A：AKAV标准曲线；B：SBV标准曲线；
[0021]图2为双重荧光RT
‑
PCR方法敏感性检测；A：AKAV
‑
FAM；B：SBV
‑
VIC；
[0022]图3为双重荧光RT
‑
PCR方法特异性扩增结果；A：AKAV
‑
FAM；B：SBV
‑
VIC；
[0023]图4为双重荧光RT
‑
PCR方法临床检测结果；A：AKAV
‑
FAM；B：SBV
‑
VIC。
具体实施方式
[0024]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0025]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript
TM RT Enzyme Mix 0.4μL，通用引物
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组，其特征在于，包括：鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的双重荧光RT
‑
PCR引物组，所述双重荧光RT
‑
PCR引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示；鉴别赤羽病病毒的如SEQ ID NO：3所示的探针和鉴别施马伦贝格病毒的如SEQ ID NO：4所示的探针。2.根据权利要求1所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组，其特征在于，所述探针5
’
端连接有荧光基团，3
’
端连接有淬灭基团，且SEQ ID NO：3所示的探针和SEQ ID NO：4所示的探针连接的荧光基团不同。3.一种如权利要求1所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组在制备鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒产品中的应用。4.一种鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1
‑
2任一项所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组。5.一种非诊断目的的鉴别赤羽病病毒和施马伦贝格病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的RNA核酸为模板，利用权利要求1所述的双重荧光RT
‑
PCR引物探针组进行双重荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冬杰，邓俊花，魏方，王晶晶，吴绍强，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：