本发明专利技术公开了一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒。引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，使用引物组配制PCR扩增体系和测序体系，经过PCR扩增反应和测序反应，再进行测序，获得HBV前C区及核心启动子区突变信息。本发明专利技术优点包括：针对HBV前C区及核心启动子区，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前C区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前C区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。200copies/μL。200copies/μL。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒
[0001]本专利技术涉及检测HBV基因
，尤其涉及检测HBV前C区基因突变技术。
技术介绍
[0002]乙型肝炎病毒英文简称HBV，有文献报道其与肝细胞肝癌、肝硬化有显著相关。HBV基因组复制时会先转录为RNA中间体，而聚合酶不能校正，导致了高突变。高变异率对HBV有效治疗来说是个不小的挑战，基因组多态性会影响乙肝诊断、治疗、预后。HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异，可导致HBeAg阴性而病毒持续复制，仅凭血清HBeAg水平并不能判断病毒复制情况，因此容易错过早期干预治疗的时机；变异也会使HBV发生耐药，是影响药物持续疗效的一个重要因素。一些临床上使用的抗HBV药物在患者身上经过一段用药时间后会出现用药无效的情况，因而症状发生恶化；也加大慢性肝炎、肝硬化、癌变倾向的概率。
[0003]因此，检测HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异对评估乙肝患者预后有一定价值，可用于联合评估肝病进展风险，拟定治疗方案及严格的随访策略，对防止或早期发现肝癌有一定临床价值，但是准确检测HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异还是存在困难。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒，以解决现有技术中不能完整、灵敏准确检测出HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异的问题。
[0005]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组，包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
[0007]更优地，还包括测序PCR引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术还提供一种所述的引物组在制备用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术还提供一种包含所述引物组的用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂盒，包含：
[0010]PCR反应液，其包括含Mg
2+
的10
×
PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0011]PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
[0012]Bigdye；
[0013]Bigdye buffer；
[0014]核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术还提供一种应用所述的引物组检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
[0016]一种包含所述的引物组的扩增体系，包括：
[0017]PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
[0018]PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0019]HBV样本核酸20μL。
[0020]一种应用所述的扩增体系的扩增方法，扩增程序为：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。
[0021]一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，
[0022]PCR扩增体系包括：
[0023]PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
[0024]PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
[0025]HBV样本核酸20μL；
[0026]测序PCR体系包括：
[0027]PCR产物XμL，X取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值1
‑
2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值4
‑
5；
[0028]Bigdye 2μL；
[0029]Bigdye buffer 3μL；
[0030]测序引物1μL；
[0031]无菌水14
‑
XμL；
[0032]测序引物如SEQ ID NO.3所示。
[0033]一种应用所述的扩增测序体系检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，过程如下：
[0034](1)提取HBV核酸作为模板；
[0035](2)配制PCR扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温；
[0036](3)配制测序PCR体系，按如下程序进行测序PCR反应：96℃预变性1分钟；96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，25个循环；4℃保温；
[0037]测序PCR产物纯化及Sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。
[0038]本专利技术的优点包括：针对HBV前C区及核心启动子区，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前C区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前C区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。
附图说明
[0039]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不
构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0040]图1是某阳性样本的部分测序峰图；
[0041]图2是实施例二的胶图；
[0042]图3是实施例三的胶图；
[0043]图4是实施例四的胶图。
具体实施方式
[0044]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，在此以本专利技术的示意性实施例及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0045]实施例一
[0046]1.实验材料
[0047]试剂：
[0048]核酸提取试剂(磁珠法，达安本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组，其特征在于：包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组，其特征在于：还包括测序PCR引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。4.一种包含如权利要求2所述引物组的用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂盒，其特征在于：包含：PCR反应液，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer5μL，10mMdNTPs1μL，10μMSEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μMSEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O17μL；PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；Bigdye；Bigdyebuffer；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.一种应用如权利要求2所述的引物组检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，其特征在于：步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。6.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：包括：PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；PCR反应液27μL，其包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer5μL，10mMdNTPs1μL，10μMSEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μMSEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O17μL；HBV样...
【专利技术属性】
技术研发人员：李葆华，甘小洪，刘菲，余治学，陈曦，
申请(专利权)人：赛立安生物技术广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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