可同时检测ASFV、PRRSV和PRV的引物和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于同时检测非洲猪瘟(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪伪狂犬病毒(PRV)的引物和探针组合，其中分别包括针对ASFV P72基因、PRRSV N基因及PRV gE基因的三组引物探针组合；进一步设计内标(针对18S rRNA序列)作为检测中质控的引物探针组合。进一步提供一种可用于同时诊断ASFV/PRRSV/PRV三种病原的多重荧光定量PCR检测试剂盒，同时提供上述检测试剂盒配套的反应液，与所有引物探针组的混合包装。本发明专利技术通过引物探针组的设计与优化，达成在一个反应中同时检测猪的三种高发病原，三种病原分别针对的特异基因互相之间扩增无干扰，具有强特异性、高灵敏度以及重复性好的特点，能够精准检测猪群的病毒感染情况，生产上具有较高应用价值，为其带来巨大的经济效益。带来巨大的经济效益。带来巨大的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
可同时检测ASFV、PRRSV和PRV的引物和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和兽医学领域，尤其涉及诊断非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬三种高发病原(ASFV、PRRSV和PRV)的一体化多重荧光定量引物和探针组合。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine repr oductive and respiratory syndrome，PRRS)与猪伪狂犬(Pseudorabies，PR)是猪场较为常见的传染性疾病，且极易发生混合感染。而混感导致了各个病原造成的临床症状变得不典型，且此三种病原的临床症状本身就有一些共性存在，如三种病原都是烈性病原、致死率高、都会导致猪发生高热、急性死亡，并且损害母猪的繁殖系统，对母猪生产性能影响大，因此很难直观的从临床症状进行直接判断。一旦爆发单个或多个病毒感染，都会对猪场造成巨大的经济损失，也因此，ASFV/PRRSV/PRV三种病原在引种过程中都需要进行严格监控。
[0003]ASF是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种猪的烈性、急性以及高度接触性传染病。ASFV是非洲猪瘟相关病毒科唯一成员，虫媒DNA病毒，基因组大(170
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190kb)，且多变，基因型多达24个，病毒的抵抗力较强，60℃可存活20分钟，56℃可存活70分钟，25
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37℃可存活数周。自2018年报道第一例疫情以来，对我国猪养殖业造成了持续性的巨大损失，危害性大，我国将其列为一类动物疫病来重点防范。国内外对于ASFV相关疫苗的研发约有100多年的时间，但目前仍未有安全有效的商品化疫苗问世。因此，对于养殖场来说，采取持续性的监测和快速准确的诊断，是防控ASF的重要手段。ASFV变异性强，在针对2020年中国家猪低毒非洲猪瘟的自然发生与流行的一项研究中表明，在国内不同地区流行的22株ASFV分离株的23个开放阅读框(ORF)或区域中，至少有8个ORF或区域发生了变异(Sun E,Zha ng Z,Wang Z,et al.Emergence and prevalence of naturally occurring lower virulent African swine fever viruses in domestic pigs in China in 2020.Sci China Life Sci.2021 May；64(5):752
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765.)。其变异性为ASF的实验室诊断带来了较大挑战。P72蛋白是ASFV的一种保守结构蛋白，其抗原性稳定且强，相比其他结构蛋白其稳定性更高，因此可用于鉴定ASFV，也是目前较为常用的诊断靶标。
[0004]PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory sy ndrome virus，PRRSV)引起的一种可感染全群，但以母猪繁殖障碍与仔猪呼吸系统疾病为主要临床危害的传染性疾病。PRRSV在我国已流行了20多年，在此期间，我们发现该病毒极易发生变异。该病于1987年首发于美国，1996年传入中国，直至2006年在我国爆发了变异毒株HP
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PRRSV，其以高发病率、高致死率迅速席卷了国内的养殖场，并从此成为一项经济意义重大的传染性疾病。与ASF有所不同，PRRS的商品化疫苗种类较多，且养殖场对PRRS的免疫较为重视，但PRRSV作为一种极易突变的RNA病毒，在高密度的免疫程序下，病毒一变再变，每隔几年，国内外就会出现有关于PRRSV的强变异毒株的报道。如我国2013年爆发的NADC30
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like PRRSV毒株；2017年我国辽宁省报道的NADC34
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like PRRSV毒株；还有目前国内养殖场常见的疫苗类似毒株，如MLV、VR2332、R98等；各类重组毒株，如QYYZ、GM2、GDQJ等；
美国2020年下半年流行的PRRSV1
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4新变异株，都对养殖业造成了较大、且持续性强的危害。因此，若仅对PRRSV进行抗体检测，往往只能够反应免疫水平，而对变异毒株的及时监测是不够的。对于PRRSV的防控应结合更为灵敏特异的分子诊断技术。PRRSV基因组全长约15kb，包含9个开放阅读框(ORFs)，ORF1区包含的Nsp2基因全长2.9kb，是PRRSV全基因组变异中最大的一个区域，主编码非结构蛋白，且具有种特异性，极易发生缺失，且缺失部分、长度不一，可作为鉴定毒株的理想靶基因(Yoshii M,Okinaga T,Miyazaki A,et al.Genetic polymorphism of the Nsp2 gene in North American type
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porcine reproductive and respiratory syndro me virus.Arch Virol.2008；153(7):1323
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34.)。而N基因相对保守，是作为病毒检测的理想靶基因。
[0005]猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，以新生仔猪的腹泻及神经症状，妊娠母猪繁殖障碍、流产、死胎及呼吸道症状，成年猪隐形感染，长期带毒排毒为特征。PRV属于α
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疱疹病毒亚科，具有疱疹病毒的典型特征，其完整病毒粒子呈球形或椭球形，有囊膜，只有一个血清型，但不同毒株的毒力有所差异。与ASFV、PRRSV不同的是，PR V的宿主范围十分广泛，它的自然宿主是猪，但也可以引起其他多种哺乳动物的感染。猪是该病毒重要的贮存宿主和传染源。在我国猪伪狂犬病的流行范围很广，尤其自2012年以来，由猪伪狂犬病毒变异株引起的猪伪狂犬病出现了新的发病特征，发病率和死亡率明显上升，给我国养猪业造成了重大的经济损失(An Tong
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qing,Peng Jin
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mei,Tian Zhi
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jun,etal.Pseudorabies virus variant in Barth a
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K61
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vaccinated pigs,China,2012[J].Emerg Infect Dis,2013,19:1749
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1755.)。该病目前尚无有效治疗药物，猪伪狂犬病的防制主要依靠自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用，虽然疫苗接种可使猪免于发病，但不能阻止野毒的潜伏感染。由于该病的流行形势发生了新变化，近年来疫苗的保护率不是很高，这给该病的防控工作大大增加了难度。gE作为PRV的主要毒力基因，决定了PR V在细胞间的扩散与病毒侵入神经系统作用，同时，gE基因也是所有PRV野毒株都具有的一个非必须基因，因此，对PRV gE基因进行检测，更能够精准的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.可检测ASFV/PRRSV/PRV中至少一种的引物和探针组合，包括：(1)针对ASFV P72基因的引物对和探针，引物对如序列1和序列2所示，探针如序列3所示；(2)针对PRRSV N基因的引物对和探针，引物对如序列4和序列5所示，探针如序列6所示；(3)针对PRV gE基因的引物对和探针，引物对如序列7和序列8所示，探针如序列9所示。2.如权利要求1所述的可检测ASFV/PRRSV/PRV中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，对探针的两端进行荧光标记修饰，用FAM修饰序列3的5
’
端，BHQ1修饰3
’
端；用HEX修饰序列6的5
’
端，BHQ1修饰3
’
端；用CY5修饰序列9的5
’
端，BHQ3修饰3
’
端。3.如权利要求2所述的可检测ASFV/PRRSV/PRV中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，还包括针对作为鉴别诊断ASFV/PRRSV/PRV的内标18SrRNA序列的引物探针组合，引物对如序列10与序列11所示，探针序列如序列12所示。4.如权利要求3所述的可检测ASFV/PRRSV/PRV中至少一种的引物和探针组合，其特征在于，用ROX修饰序列12的5
’
端，BHQ2修饰3
’
端。5.可检测ASFV/PRRSV/PRV中至少一种的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1
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4中任一项所述的可检测ASFV/PRRSV/PRV中的至少一种引物和探针组合。6.如权利要求5所述的可检测ASFV/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，林青青，王永强，
申请(专利权)人：泰州蕾灵百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：