一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，其中介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列，可以预先与Cas蛋白孵育获得Cas

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光生物传感及核酸检测
，具体涉及一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。作为一种适应性免疫系统，CRISPR/Cas系统使用crRNA引导的核酸酶切割外源基因元件。
[0003]在crRNA引导的DNA/RNA结合后，Cas蛋白表现出对靶标DNA/RNA特异性切割和对邻近DNA/RNA非特异性切割能力，Cas蛋白的侧式切割活性已适用于检测用于疾病诊断的序列特异性DNA/RNA。相比于PCR技术，利用CRISPR技术检测病毒核酸在反应时间和操作成本方面具有显著优势。
[0004]对于CRISPR技术而言，实现复杂实际样本中信号的放大存在难点。单链DNA/RNA修饰信号分子数量有限且稳定性和抗干扰能力差，在复杂基质中难以被识别且易于降解，导致低信噪比。因此现有技术中检测病毒核酸的检测方案普遍存在耗时长、受大型仪器限制、有条件限制、操作复杂、信噪比低等缺点。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用，可用于病毒核酸检测，实现对病毒核酸的即时、快速、准确、经济检测。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，用于荧光信号的输出；
[0008]所述基因编辑探针包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，所述介导crRNA预先与所述Cas蛋白孵育获得Cas
‑
crRNA复合物，作为识别模块；
[0009]所述介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列；所述Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas14；
[0010]所述磁性探针是由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，作为信号模块。
[0011]优选地，所述病毒核酸为非洲猪瘟病毒ASFV，具有如SEQ ID No.1
‑
2所示的序列；
所述介导crRNA具有如SEQ ID No.3所示的序列。
[0012]优选地，所述病毒核酸为新型布尼亚病毒SFTSV，具有如SEQ ID No.5
‑
6所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.7所示的序列。
[0013]优选地，所述磁珠是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm；所述荧光标记的单链核酸长度为5nt以上。
[0014]优选地，所述Cas
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crRNA复合物浓度为10nM～1μM；当所述Cas蛋白为Cas12a或Cas14时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链DNA；当所述Cas蛋白为Cas13时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链RNA；所述荧光标记的单链核酸的浓度为10～3000nM。
[0015]优选地，所述荧光标记的单链核酸，其一端连有生物素或氨基，能够使荧光标记的单链核酸连接到链霉亲和素或羧基修饰的磁珠上，其另一端修饰有荧光基团；所述荧光基团为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
[0016]一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0017]步骤1)利用CRISPR/Cas技术构建识别模块Cas
‑
crRNA复合物：首先针对病毒核酸靶标的基因序列设计与之互补的crRNA，再将Cas蛋白与crRNA以浓度比1:1混合于1
×
NEBuffer 2.1中，在室温下孵育10min，获得Cas
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crRNA复合物作为识别模块；
[0018]步骤2)将荧光标记的单链核酸通过生物素
‑
链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，通过磁分离去除多余的荧光标记的单链核酸，并对组装后的磁珠进行清洗和重新分散，构建信号模块，实现对荧光分子的富集；
[0019]步骤3)将步骤1)所得识别模块与步骤2)所得信号模块组成试剂盒，即得。
[0020]优选地，步骤2)所述将荧光标记的单链核酸通过生物素
‑
链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，具体步骤包括以下两种方案：
[0021]方案(A)：将生物素化的荧光标记的单链核酸和链霉亲和素修饰的磁珠在连接缓冲液中混合，并对组装后的磁珠进行清洗，去除多余的荧光标记的单链核酸，将得到的磁珠分散在DEPC水中储存，即得；
[0022]所述连接缓冲液为：10mM Tris
‑
HCl，2M NaCl，1mM EDTA，pH＝7.4；
[0023]或方案(B)：将羧基修饰的磁珠稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入氨基修饰的荧光标记的单链核酸，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁珠分散在DEPC水中，即得；
[0024]所述MES缓冲液为：100mM MES，pH＝6.0；
[0025]所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0；
[0026]所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0；
[0027]所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH＝7.2。
[0028]上述的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，或上述制备方法制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒在非疾病诊断目的的病毒核酸检测中的应用。
[0029]优选地，非疾病诊断目的的病毒核酸检测包括以下步骤：
[0030]将识别模块与信号模块混合，向其中加入待测样本进行反应，在25～43℃下反应5
～30min后，通过磁分离，收集上清液，检测荧光信号，产生荧光信号则为阳性。
[0031]本专利技术的有益效果如下：
[0032](1)本专利技术采用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，用于荧光信号的输出；所述基因编辑探针包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，所述介导crRNA预先与所述Cas蛋白孵育获得Cas
‑
crRNA复合物，作为识别模块；所述介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列；所述Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas14；所述磁性探针是由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，作为信号模块。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸为非洲猪瘟病毒ASFV，具有如SEQ ID No.1
‑
2所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.3所示的序列。3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸为新型布尼亚病毒SFTSV，具有如SEQ IDNo.5
‑
6所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.7所示的序列。4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm；所述荧光标记的单链核酸长度为5nt以上。5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Cas
‑
crRNA复合物浓度为10nM～1μM；当所述Cas蛋白为Cas12a或Cas14时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链DNA；当所述Cas蛋白为Cas13时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链RNA；所述荧光标记的单链核酸的浓度为10～3000nM。6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的单链核酸，其一端连有生物素或氨基，能够使荧光标记的单链核酸连接到链霉亲和素或羧基修饰的磁珠上，其另一端修饰有荧光基团；所述荧光基团为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。7.权利要求1
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6任一项所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛振元，苏桐，朱丹，汪联辉，晁洁，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：