荧光定量PCR检测miR-122的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种荧光定量PCR检测miR

【技术实现步骤摘要】
荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法及其应用。

技术介绍

[0002]miRNAs是广泛存在于生物体内的一类单链内源性非编码RNAs，通过与mRNA的3'非翻译区的不完全碱基互补配对来诱导mRNA转录后的降解和抑制其翻译，调控机体许多病理学和生理学过程，包括细胞的代谢、分化和凋亡。研究发现，在许多肿瘤发生、发展和病毒侵染时，miR
‑
122在组织或体液中存在不同程度地异常表达，且其表达水平的差异程度与疾病相关的趋化因子或诊断标志物的表达情况高度一致。miR
‑
122为研究一些肿瘤发展的分子机制、病毒侵染途径及致病性等方面提供了新的方向，也有望成为某些癌症早期筛查和预后诊断的重要分子标志物。
[0003]目前检测miRNA的方法主要有微阵列、新一代测序(NGS)和逆转录实时荧光定量PCR技术(RT
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qPCR)等。但是由于miRNA的序列较短、在生物体内丰度差异大，传统的miRNA检测方法仍然存在灵敏度低、特异性差等难题。miRNA在生物体内的精确定量对其生物学功能和作为疾病诊断标志物的研究都至关重要，因此建立灵敏度高、特异性强、成本低的miRNA检测方法具有重要的意义。
[0004]综上所述，如何建立灵敏度高、特异性强、成本低的miRNA检测方法，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路
r/>[0005]本专利技术实施例的主要目的在于提出一种荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法及其应用，旨在建立灵敏度高、特异性强、成本低的miRNA检测方法。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案是，提供一种荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法，其步骤包括：
[0007]杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上；
[0008]将连接酶加入杂交反应体系中，连接片段A和连接片段B通过连接酶连接，得到DNA单链；
[0009]将DNA单链加入包括引物、荧光探针、DNA聚合酶的qPCR反应体系中，反应得到扩增产物。
[0010]在本专利技术一实施例中，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤中，所述杂交反应体系包括：连接酶反应缓冲液、连接片段A、连接片段B、模板及水；
[0011]其中，所述模板包括miR
‑
122和cel
‑
miR
‑
39。
[0012]在本专利技术一实施例中，所述杂交反应体系的配比为1
×
SplintR连接酶反应缓冲液、10nM连接片段A、10nM连接片段B和0.1ng/μL～0.1fg/μL模板，补充水至总反应体系9μL。
[0013]在本专利技术一实施例中，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤包括：
[0014]将杂交反应体系置于PCR管中，吹打均匀，放在冰上进行反应；
[0015]将含有杂交反应体系的PCR管置于PCR仪上反应。
[0016]在本专利技术一实施例中，所述将含有杂交反应体系的PCR管置于PCR仪上反应的步骤中，杂交反应体系在的PCR仪上的反应条件依次包括第一变性阶段、第二退火阶段及第三保温阶段；
[0017]所述第一变性阶段的反应条件为反应温度90℃，反应时间5min；
[0018]所述第二退火阶段的反应条件为反应温度51℃，反应时间40min；
[0019]所述第三保温阶段的反应条件为反应温度37℃。
[0020]在本专利技术一实施例中，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤中，所述杂交反应体系中的连接片段B在碱基序列的5'端被磷酸化修饰。
[0021]在本专利技术一实施例中，所述杂交反应体系中：所述miR
‑
122的核酸序列包括GGAGUGUGACAAUGGUGUUUG，所述cel
‑
miR
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39的核酸序列包括UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG；所述连接片段A的核酸序列包括CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGACCAAACACCAT和CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGACCAAGCTGATTTACACCCG；所述被磷酸化修饰后的连接片段B的核苷酸序列包括pTGTCACACTCCACTGAGTCGGAGACACGCAGGGCTTAA和pGTGACqGAGTCGGAGACACGCAGGGCTTAA。
[0022]在本专利技术一实施例中，所述将连接酶加入杂交反应体系中，连接片段A和连接片段B通过连接酶连接，得到DNA单链的步骤包括：
[0023]将25units的SplintR连接酶加入杂交反应体系中，混匀，并置于PCR仪上反应；
[0024]杂交反应体系中的连接片段A和连接片段B通过SplintR连接酶连接，得到DNA单链；
[0025]其中，混合液在PCR仪上的反应条件包括第一连接阶段、第二热失活阶段；所述第一连接阶段的反应条件为：反应温度37℃，反应时间2h；所述第二热失活阶段的反应条件为：反应温度65℃，反应时间20min。
[0026]在本专利技术一实施例中，所述将DNA单链加入包括引物、荧光探针、DNA聚合酶的qPCR反应体系中，反应得到扩增产物的步骤中，所述qPCR反应体系包括Premix Ex Taq(Probe qPCR)、引物、荧光探针和水；所述引物包括正向引物和反向引物；
[0027]所述qPCR反应体系的配比为：1
×
Premix Ex Taq(Probe qPCR)、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物及0.4μM荧光探针，补充水至总反应体系25μL。
[0028]在本专利技术一实施例中，所述将DNA单链加入包括引物、荧光探针、DNA聚合酶的qPCR反应体系中，反应得到扩增产物的步骤包括：
[0029]将qPCR反应体系和DNA单链的混合物置于荧光定量八联管中，吹打混匀；
[0030]将荧光定量八联管放入离心机中离心5s后，将混合物放置在冰上进行qPCR反应；
[0031]将反应后的荧光定量八联管置于荧光定量PCR仪反应；
[0032]其中，荧光定量八联管在荧光定量PCR仪上的反应条件包括第一预变性阶段、第二变性阶段、第三退火阶段及第四保温阶段；
[0033]所述第一预变性阶段的反应条件为温度95℃，时间30sec，循环数1；
[0034]第二变性阶段的反应条件为温度95℃，时间5sec，循环数45；
[0035]第三退火阶段的反应条件为温度60本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR检测miR
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122的方法，其特征在于，其步骤包括：杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上；将连接酶加入杂交反应体系中，连接片段A和连接片段B通过连接酶连接，得到DNA单链；将DNA单链加入包括引物、荧光探针、DNA聚合酶的qPCR反应体系中，反应得到扩增产物。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法，其特征在于，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤中，所述杂交反应体系包括：连接酶反应缓冲液、连接片段A、连接片段B、模板及水；其中，所述模板包括miR
‑
122和cel
‑
miR
‑
39。3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法，其特征在于，所述杂交反应体系的配比为1
×
SplintR连接酶反应缓冲液、10nM连接片段A、10nM连接片段B和0.1ng/μL～0.1fg/μL模板，补充水至总反应体系9μL。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR检测miR
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122的方法，其特征在于，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤包括：将杂交反应体系置于PCR管中，吹打均匀，放在冰上进行反应；将含有杂交反应体系的PCR管置于PCR仪上反应；其中，杂交反应体系在的PCR仪上的反应条件依次包括第一变性阶段、第二退火阶段及第三保温阶段；所述第一变性阶段的反应条件为反应温度90℃，反应时间5min；所述第二退火阶段的反应条件为反应温度51℃，反应时间40min；所述第三保温阶段的反应条件为反应温度37℃。5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法，其特征在于，所述杂交反应体系中的miR
‑
122分别结合在连接片段A和连接片段B上的步骤中，所述杂交反应体系中的连接片段B在碱基序列的5'端被磷酸化修饰。6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测miR
‑
122的方法，其特征在于，所述杂交反应体系中：所述miR
‑
122的核酸序列包括GGAGUGUGACAAUGGUGUUUG，所述cel
‑
miR
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39的核酸序列包括UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG；所述连接片段A的核酸序列包括CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：单亚明，高峰，许建成，张雅鑫，吕佳琳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：