一种动物体内人源细胞的检测方法及用途技术

一种动物体内人源细胞的检测方法，基于高分辨率熔解曲线技术来区分人源与动物SNCA基因碱基序列的差异来检测人源细胞在动物体内的驻留位置和代谢情况。利用人源细胞和动物细胞物种间SNCA基因碱基序列的固有差异来区分并定量两种细胞，使用的同源基因为SNCA基因，不用对人源细胞做任何的修饰与标记，避开了标记细胞膜的不稳定性和标记核酸的不安全性；同时利用高分辨率熔解曲线技术能够精确区分动物组织基因组DNA样本中人源基因DNA片段信息，结果体现为直观的熔解曲线，检测操作简单，数据重复性极高，结果精确可靠。结果精确可靠。结果精确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种动物体内人源细胞的检测方法及用途


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种动物体内人源细胞的检测方法及用途。

技术介绍

[0002]目前在干细胞治疗进入临床研究前，必须在动物体内进行有效性和安全性的研究，也就是人体来源的干细胞，移植到动物(可能是疾病模型动物)体内，检测对某种病变的改善效果及其干细胞移植的安全性。在该过程中如何检测人源干细胞进入动物体内后的驻留位置以及代谢时间是极为重要的干细胞临床研究安全性评估的依据。但是目前在动物体内的检测人源细胞的方法比较有限。
[0003]细胞膜荧光标记细胞后移植入动物体内，可能会因为膜分子的交换导致荧光不明显，定位不准确，让追踪细胞驻留位置变得极为困难；此外标记细胞膜可能影响细胞安全性。
[0004]流式细胞仪检测人源干细胞特有的表面抗原的方法有一定的准确性。然而，人源细胞移植到动物体内后，可能驻留在各个不同器官或组织，很难重新收集并有效检测。
[0005]人源细胞核酸标记(放射性或荧光标记等)虽然能比较特异性追踪细胞位置，但是外源性引入其他因素可能对细胞在动物体内的安全性产生重大影响。因此，该类方法应用于临床前研究来追踪人源细胞会存在无法克服的局限性。
[0006]开发既不影响人源细胞特性，保证细胞安全性同时又能精确检测人源细胞驻留位置以及代谢时间的方法是目前干细胞临床研究亟待解决的问题。因此，针对现有技术不足，提供一种动物体内人源细胞的检测方法以克服现有技术不足甚为必要。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一在于避免现有技术的不足之处而提供一种动物体内人源细胞的检测方法；在不影响细胞安全性的前提下，能够准确检测人源细胞在动物体内的驻留位置和代谢情况。
[0008]本专利技术的上述目的通过如下技术手段实现。
[0009]提供一种动物体内人源细胞的检测方法，通过高分辨率熔解曲线(HRM)技术检测动物与人同源基因扩增片段的熔解温度(Tm)差异来区分动物体内是否存在人源细胞。
[0010]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，具体根据动物和人同源基因扩增片段的碱基序列差异所致的熔解曲线差异来区分判读。
[0011]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，使用的同源基因为SNCA基因；同源基因扩增引物序列为：前引物：GAGACTACTACAGAGTGCTAAGC，后引物：CCATTTCTCTCTAGTGTAAGATGAC；
[0012]引物PCR扩增片段的核酸信息为：
[0013]5'CCATTTCTCTCTAGTGTAAGATGACACATGCAGCTTAGCACTCTGTAGTAGTCTC 3'
[0014]3'GGTAAAGAGAGATCACATTCTACTGTGTACGTCGAATCGTGAGACATCATCAGAG5'。
[0015]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，PCR扩增程序为：95摄氏度变性10秒，55摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸10秒，以上操作循环40次；然后72摄氏度后延伸1分钟结束。
[0016]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，具体通过如下步骤进行：
[0017]S1，取待判定动物待判定器官或组织，提取其基因组DNA；
[0018]S2，以所述基因组DNA为模版，用前、后引物进行PCR扩增，得到含有动物与人同源基因SNCA扩增片段的PCR扩增产物；
[0019]S3，在所述PCR扩增产物中添加核酸饱和荧光染料LC Green，然后利用LightScanner96系统(美国，Idaho)将扩增产物从45摄氏度开始以每秒0.1度的速度持续升温至98摄氏度；随着温度逐渐升高，DNA扩增产物的双链熔解并释放LC Green致其荧光强度逐渐降低，实时记录荧光强度与温度的变化，获得其荧光强度随温度变化的高分辨率熔解曲线(HRM)；LightScanner96系统软件将熔解曲线自动转化为荧光强度随温度变化的峰图，产物熔解峰对应的温度为产物的熔解温度(Tm)；
[0020]S4，根据熔解曲线判读PCR扩增产物中是否存在人源SNCA基因的特异性扩增片段，从而待判定动物组织中是否存在人源细胞。只有模板中存在来自于人源细胞的基因组DNA，PCR扩增产物中才能获得人源SNCA基因的特异性扩增片段。
[0021]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，检测熔解曲线的峰值(Tm)判读是否存在人源细胞。
[0022]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，参照预先设置的人源和动物源同源基因SNCA扩增片段的标准HRM曲线作为内部标准与熔解曲线判读是否存在人源细胞。
[0023]优选的，上述的动物体内人源细胞的检测方法，分辨率达精确检测小鼠细胞中1/100000人源细胞。
[0024]本专利技术另提供上述动物体内人源细胞的检测方法在人源干细胞移植到动物体内后长时间跟踪分析中的用途。
[0025]本专利技术另提供上述动物体内人源细胞的检测方法用于人源细胞在动物器官或者组织内驻留、增殖或者成瘤性鉴定中的用途。
[0026]本专利技术的动物体内人源细胞的检测方法，基于高分辨率熔解曲线技术来区分人源与动物SNCA基因碱基序列的差异来检测人源细胞在动物体内的驻留位置和代谢情况。利用人源细胞和动物细胞物种间SNCA基因碱基序列的固有差异来区分并定量两种细胞，不用对人源细胞做任何的修饰与标记，完美的避开了标记细胞膜的不稳定性和标记核酸的不安全性；同时利用高分辨率熔解曲线技术能够精确区分动物组织基因组DNA样本中人源基因DNA片段信息，结果体现为直观的熔解曲线，检测操作简单，数据重复性极高，结果精确可靠。
[0027]说明书附图
[0028]利用附图对本专利技术作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本专利技术的任何限制。
[0029]图1是以不同比例两种物种细胞样本基因组DNA为模板的PCR扩增产物的熔解曲线结果，其中A是SNCA基因扩增产物HRM峰图，B是以人源DNA扩增产物熔解曲线为标准转化后的特征曲线。
[0030]图2是本专利技术实施例2样本的扩增产物的熔解曲线结果，其中A是人源间充质干细胞注射小鼠后肺组织SNCA基因扩增产物HRM峰图，B是以人源间充质干细胞注射小鼠后肺组织SNCA基因扩增产物熔解曲线为标准转化后的特征曲线。
[0031]图3是本专利技术实施例3样本的扩增产物的熔解曲线结果，其中A是干细胞注射小鼠后肺及心脏组织SNCA基因扩增产物HRM峰图，B是以干细胞注射小鼠后肺及心脏组织样本扩增产物熔解曲线为标准转化后的特征曲线。
具体实施方式
[0032]结合以下实施例对本专利技术作进一步说明。
[0033]实施例1。
[0034]一种动物体内人源细胞的检测方法，通过高分辨率熔解曲线(HRM)技术检测动物与人同源基因扩增片段的熔解温度(Tm)差异来区分动物体内是否存在人源细胞，具体根据动物和人同源基因扩增片段的碱基序列差异所致的熔解曲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种动物体内人源细胞的检测方法，其特征在于，通过高分辨率熔解曲线技术检测动物与人同源基因扩增片段的熔解温度差异来区分动物体内是否存在人源细胞。2.根据权利要求1所述的动物体内人源细胞的检测方法，其特征在于，根据动物和人同源基因扩增片段的碱基序列差异所致的熔解曲线差异来区分判读。3.根据权利要求2所述的动物体内人源细胞的检测方法，其特征在于，使用的同源基因为SNCA基因；同源基因扩增引物序列为：前引物：GAGACTACTACAGAGTGCTAAGC，后引物：CCATTTCTCTCTAGTGTAAGATGAC；引物PCR扩增片段的核酸信息为：5'CCATTTCTCTCTAGTGTAAGATGACACATGCAGCTTAGCACTCTGTAGTAGTCTC 3'3'GGTAAAGAGAGATCACATTCTACTGTGTACGTCGAATCGTGAGACATCATCAGAG5'。4.根据权利要求3所述的动物体内人源细胞的检测方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95摄氏度变性10秒，55摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸10秒，以上操作循环40次；然后72摄氏度后延伸1分钟结束。5.根据权利要求3或4所述的动物体内人源细胞的检测方法，其特征在于，具体通过如下步骤进行：S1，取待判定动物待判定器官或组织，提取其基因组DNA；S2，以所述基因组DNA为模版，用前、后引物进行PCR扩增，得到含有动物与人同源基因SNCA扩增片段的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家丰，徐宇霞，楚佳奇，魏波，洪冠豪，周玉兰，
申请(专利权)人：广东医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：