一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法技术

本发明专利技术公开了一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法，包括以下步骤：对微量细胞进行基因组核酸扩增；对所述扩增产物进行全基因组建库；用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；将杂交捕获的文库进行测序，并分析各SNP位点的等位基因突变频率和测序深度；对突变频率低于20％的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应；将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到对脱扣等位基因的富集结果。本发明专利技术还公开了一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的检测体系及其在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。本发明专利技术方法通过特异性富集突变序列，可对脱扣位置进行直接而准确的富集和检测，显著降低PGT

【技术实现步骤摘要】
一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法。

技术介绍

[0002]减少人口出生缺陷是国家基本国策，PGT
‑
M(胚胎植入前单基因遗传病检测)是阻断严重遗传病代际传递的重要手段，也是选择胚胎的唯一依据，现有的胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT
‑
M)流程如图1所示。然而，等位基因脱扣(Allele Drop
‑
Out，ADO)现象一直是困扰PGT
‑
M应用的重要原因之一。
[0003]PGT检测利用的是极少量的胚胎活检细胞，由于样本量极少，检测前需要运用分子生物学的方法对极少量的遗传物质进行全基因组扩增，此时等位基因可能发生不对称扩增，即其中一个等位基因被优势扩增，另一个等位基因并未被扩增或扩增较少，导致在后期检测过程中只检测到其中一个等位基因，另一个等位基因未被检测到，这种情况被称为“等位基因脱扣”。PGT检测过程中如果等位基因脱扣，会造成单核苷酸变异检测结果假阳性或者假阴性，就可能导致误诊及可用胚胎数目减少，这是现有检测技术的局限性。
[0004]当前用于单细胞全基因组扩增的技术，例如MDA(Qiagen，GE)、MALBAC(Yikon)、DOP
‑
PCR(Sigma)、MALBAC
‑
like(Rubicon)，脱扣比例都不低，在30％～80％左右。
[0005]目前使用连锁分析方法间接诊断胚胎基因型：通过NGS或芯片检测父母和胚胎的目标基因上下游1
‑
2M内SNP，再通过连锁分析判断胚胎是否携带基因突变。考虑到胚胎单细胞材料的珍贵性以及脱扣现象的严重影响，PGT
‑
M检测几乎全部都是利用构建单倍型加上目标位点直接检测的方式鉴别致病位点信息，医生并不会仅仅直接检测胚胎目标基因中是否存在与父母一样的突变，而是通过家系样本先判断致病突变分别位于家系成员的哪一条染色体上，跟哪些分子标记连锁(也就是单体型分型，把致病染色体与非致病染色体区分开)，然后在根据单体型分析的结果，判断胚胎是否遗传了父母致病的染色体，从遗传原理上分析胚胎是否有患病风险，选择没有发病风险、并且目标基因测序无致病突变位点的胚胎进行植入。即便如此，在选用的分子标记数量很少的情况下，仍然容易被ADO影响。这种PGT
‑
M检测的劣势：成本高、周期长、检测方法繁琐复杂。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决目前临床PGT
‑
M检测存在最高可达20％左右脱扣现象的技术问题，提供一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法，该方法通过特异性富集突变序列，可对脱扣位置进行直接而准确的富集和检测，显著降低PGT
‑
M检测中的脱扣现象。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
[0008]在本专利技术的一个方面，提供了一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法，包括以下步骤：
[0009]对微量细胞进行基因组核酸扩增；
[0010]对所述扩增产物进行全基因组建库；
[0011]用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；
[0012]将杂交捕获的文库进行测序，并分析各SNP位点的等位基因突变频率和测序深度；
[0013]对突变频率低于20％的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；
[0014]将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到对脱扣等位基因的富集结果。
[0015]所述微量细胞包括一个或若干个细胞。
[0016]所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。
[0017]在本专利技术的另一方面，还提供了一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的检测体系，所述检测体系包括：针对SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
[0018]所述SNP位点为突变频率低于20％的SNP位点，本专利技术的检测体系能将突变频率小于1％的SNP位点通过富集结果检测出来。
[0019]所述检测体系还包括聚合酶和基因组DNA，所述检测体系为PCR扩增反应体系。
[0020]在本专利技术的另一方面，还提供了一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的检测试剂盒，包含针对SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
[0021]在本专利技术的另一方面，还提供了上述检测体系在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。
[0022]在本专利技术的另一方面，还提供了上述检测试剂盒在制备胚胎植入前单基因遗传病诊断产品中的应用。
[0023]本专利技术克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法，通过富集放大检测的低比例变异，在保证准确性和特异性的同时，不仅能够消除脱扣现象对PGT
‑
M应用的影响，而且直接检测单细胞全基因扩增产物中的致病位点信息，可以避免构建单倍型、减低检测成本、让PGT
‑
M获得最为直观的结果。
附图说明
[0024]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0025]图1是本专利技术现有胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT
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M)流程示意图；
[0026]图2是本专利技术实施例1的部分SNP位点经BDA扩增后LOD检测结果图；
[0027]图3是本专利技术实施例2单细胞扩增产物的等位基因脱扣率统计分析图；
[0028]图4是本专利技术实施例2杂合SNP位点在1/3/6细胞扩增产物中的比例分析统计图；
[0029]图5是本专利技术实施例3对28个SNP位点经BDA扩增后sanger测序可见突变峰(>20％)的部分SNP位点突变峰结果图。
具体实施方式
[0030]实施例1 证明抑制探针置换扩增(Blocker Displacement Amplification，BDA)技术在不同位点中和不同比例浓度范围内的普适性
[0031]1候选标准品样本的筛选(生物信息学分析)
[0032]1.1筛选合适的标准品来源样本：对14例志愿者样本(编号缩写LJF,YHX,YYX,CLL,GX,ZW,BW,TR,LSS,WJP,LRQ,XX,CMM,DBH)进行WES(人类全外显子捕获测序)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的方法，其特征在于，包括以下步骤：对微量细胞进行基因组核酸扩增；对所述扩增产物进行全基因组建库；用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；将杂交捕获的文库进行测序，并分析各SNP位点的等位基因突变频率和测序深度；对突变频率低于20％的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到对脱扣等位基因的富集结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量细胞包括一个或若干个细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。4.一种克服微量细胞扩增等位基因脱扣的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：针对SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晨明，陈松长，黄荷凤，罗俊峰，汪进平，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：