使用实时荧光PCR法检测TBLR1‑RARα融合基因的引物和探针及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种使用实时荧光PCR法检测TBLR1‑RARα融合基因的引物和探针及应用。使用该引物、探针和方法完全能满足临床对灵敏度高、检测流程简便和MRD监测的需求。

Using real time fluorescent PCR detection of TBLR1 RAR alpha fusion gene primers and probes and its application

The invention provides a real-time fluorescent PCR detection of TBLR1 RAR alpha fusion gene primers and probes and its application. The use of the primers, probes and methods can fully meet the needs of high sensitivity, simple detection process and MRD monitoring.

【技术实现步骤摘要】
使用实时荧光PCR法检测TBLR1-RARα融合基因的引物和探针及应用
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及一种采用TAQMAN探针及实时荧光PCR技术定量检测TBLR1-RARα融合基因的方法、引物、探针及试剂盒。实时荧光PCR技术成熟且通量大，适于辅助临床诊断及微小残留病灶的监测。技术背景急性早幼粒细胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓系白血病(Acutemyeloidleukemia,AML)中的一类特殊的疾病。因其治疗方案不同于其他类型的AML，且该类病患通常病情危机易出血，常因弥漫性血管内凝血(DIC)而病故；故在诊断时必须从AML中区分出来，进行及时的治疗。APL的诊断关键是找到特异的染色体或基因异常。几乎所有的APL都涉及染色体17(q21)的易位，即RARα基因参与的重排融合。其中＞95％的病例为t(15；17)(q22；q21)，产生PML-RARα融合基因；但仍有少数的不典型病例会涉及其他的染色体和基因与RARα基因发生融合。如11号染色体上的PLZF和NuMA基因，5号染色体上的NPM1基因及3号染色体上的TBLR1基因等。此外，不同的基因与RARα基因发生融合，对APL的治疗药物维甲酸的反应是不一样的。如PML-RARα、NPM1-RARα及NuMA-RARα阳性的患者对维甲酸治疗有反应；而PLZF-RARα阳性的患者对维甲酸治疗耐药。所以，精准快速地找到RARα基因参与的融合，并且确认参与融合的伙伴基因对APL的快速诊断及治疗方案的确定具有极其重要的意义。TBLR1-RARα融合基因，是至今第10种涉及RARα的罕见融合基因；文献报道只有4例。由于样本量少，其对维甲酸治疗的反应性尚不明确。临床尚无针对该融合基因的荧光定量检测试剂，只有通过染色体核型分析时偶然发现。但由于染色体核型分析技术自身的缺点：如需要进行细胞培养，检测周期长；受到核分裂相多少及质量的影响；及灵敏度低等的限制，并不能满足临床快速有效诊断与治疗的要求，也无法达到微小残留病灶(MRD)监测所需的灵敏度要求。
技术实现思路
鉴于目前尚无检测TBLR1-RARα融合基因的试剂，本专利技术考虑使用TAQMAN探针及实时荧光PCR技术的方法对TBLR1-RARα融合基因进行定量检测，以满足临床对灵敏度高、检测流程简便和MRD监测的需求。一种使用TAQMAN探针实时荧光PCR技术，检测TBLR1-RARα融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：TBLR1-F：5’-GGGAGGAGAATGGAGCACA-3’RARA-R：5’-AGGGCTGGGCACTATCTCTTC-3’RARA-P：5’-FAM-CCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTC-TAMRA-3’。进一步地，所述引物和探针还包括用于扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：ABL-F：5’-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’ABL-R：5’-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’ABL-P：5’-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’。本专利技术还提供了一种检测TBLR1-RARα融合基因的方法，包括以下步骤：(1)提取全血样本中的有核细胞；(2)提取步骤1中有核细胞中的总RNA，并将RNA反转录成cDNA；(3)以步骤2的cDNA为模板，进行TBLR1-RARα融合基因的定量检测。融合基因定量检测包括上游引物TBLR1-F、下游引物RARA-R和探针RARA-P的序列，其包括：TBLR1-F：5’-GGGAGGAGAATGGAGCACA-3’RARA-R：5’-AGGGCTGGGCACTATCTCTTC-3’RARA-P：5’-FAM-CCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTC-TAMRA-3。检测时，还可包括用于扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针。更为具体的，步骤1中的红细胞裂解液为10×红细胞裂解液，其配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。步骤2采用TRIzolRNA提取方法提取有核细胞中的总RNA步骤3融合基因的定量检测的反应条件为：95℃预变性1min；95℃10s，58℃50s，共40个循环；58℃时采集荧光。本专利技术还提供了一种检测TBLR1-RARα融合基因的试剂盒，包括用于检测TBLR1-RARα融合基因的引物和探针，所述上游引物TBLR1-F、下游引物RARA-R和探针RARA-P的序列包括：TBLR1-F：5’-GGGAGGAGAATGGAGCACA-3’RARA-R：5’-AGGGCTGGGCACTATCTCTTC-3’RARA-P：5’-FAM-CCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTC-TAMRA-3；试剂盒还可进一步包括还包括用于扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针。试剂盒内还提供了红细胞裂解液。所述红细胞裂解液为10×红细胞裂解液，其配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。本专利技术的有益效果为：本使用TAQMAN探针及实时荧光PCR技术的方法对TBLR1-RARα融合基因进行定量检测，完全能满足临床对灵敏度高、检测流程简便和MRD监测的需求。附图说明图1是本专利技术引物及探针设计位置图。图2是使用本专利技术引物探针及方法对临床疑似样本1进行检测的荧光扩增曲线图。图3是使用本专利技术引物探针及方法对临床疑似样本2进行检测的荧光扩增曲线图。具体实施方式实施例1：全血RNA的提取：在1.5ml离心管中加入1ml1×红细胞裂解液，取待检全血样本0.5ml，颠倒混匀。4000rpm离心3min，吸弃上清，加红细胞裂解液洗涤一次，得所需细胞；加lmlTotalRNAIsolationReagent，反复吹吸直至无明显细胞团块，加入氯仿200μl，漩涡混匀30s，冰上静置10min。14,000rpm，4℃离心10min。用移液器吸取上清液450μl转移至另一离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀后在冰上静置10min。14,000rpm，4℃离心10min。然后用75％的乙醇和无水乙醇分别洗涤离心一次。室温干燥5min，加入50μlDEPC-H2O溶解。10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。实施例2：逆转录：取实施例1中RNA溶液4ul(浓度约200ng/ul)加1ulPrimermix(ReverTraAceqPCRRTKit)和3ulDEPC-H2O混匀，70℃预变性5min；冰上骤冷1min后加入5*RTbuffer4ul(ReverTraAceqPCRRTKit)，EnzymeMix1ul(ReverTraAceqPCRRTKit)，并加DEPC-H207ul至总体积为20ul。37℃60min反应后98℃5min灭活，所得即为待检样本的cDNA。实施例3：荧光定量PCR：按表1所示试剂及试剂量配置荧光定量PCR检测体系。检测试剂共含2本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测TBLR1‑RARα融合基因的引物和探针，其特征在于，所述上游引物TBLR1‑F、下游引物RARA‑R和探针RARA‑P的序列包括：TBLR1‑F：5’‑GGGAGGAGAATGGAGCACA‑3’RARA‑R：5’‑AGGGCTGGGCACTATCTCTTC‑3’RARA‑P：5’‑FAM‑CCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTC‑TAMRA‑3’。

【技术特征摘要】
1.检测TBLR1-RARα融合基因的引物和探针，其特征在于，所述上游引物TBLR1-F、下游引物RARA-R和探针RARA-P的序列包括：TBLR1-F：5’-GGGAGGAGAATGGAGCACA-3’RARA-R：5’-AGGGCTGGGCACTATCTCTTC-3’RARA-P：5’-FAM-CCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTC-TAMRA-3’。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括用于扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：ABL-F：5’-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’ABL-R：5’-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’ABL-P：5’-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’。3.一种检测TBLR1-RARα融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取全血样本中的有核细胞；(2)提取步骤1中有核细胞中的总RNA，并将RNA反转录成cDNA；(3)以步骤2的cDNA为模板，进行TBLR1-RARα融合基因的定量检测；所述融合基因定量检测包括上游引物TBLR1-F、下游引物RARA-R和探针RARA-P的序列，其包括：TBLR1-F：5’-GGGAGGAGAATGGAGCACA-3’RARA-R：5’-AGGGCTGGGCACTATCTCTTC-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹媛，杜翠，
申请(专利权)人：武汉艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42