KRAS基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法技术

本发明专利技术公开了一种KRAS基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法，将含有KRAS基因7个常见突变型的细胞系DNA作为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物经过Sanger测序验证后，与经过超声波片断化的野生型人基因组DNA通过天平称量按照一定比例进行混合，可获得KRAS基因7种突变的定量标准品。本发明专利技术提供了定量标准品的制备方法，采用片段化的野生型人基因组DNA作为背景DNA，可以更好的模拟实际检测样本的背景。本定量标准品的定值方法精密度好，准确度高，不依赖于DNA标准品，测量结果可溯源至国际基本单位(质量)，从而保证测量结果的可靠和可溯源。本定量标准品可用于KRAS基因突变检测方法的方法验证和质量控制。

Quantitative standard product of KRAS gene mutation detection, preparation method and fixed value method

The invention discloses a method for detection of KRAS gene mutation in the quantitative standard and its preparation method and value method, KRAS gene containing 7 common mutations of DNA cells as the template for PCR amplification, PCR products by Sanger after sequencing, and after ultrasonic fragmentation of wild-type human genomic DNA by balance weighing according to a certain proportion are mixed, can obtain 7 KRAS gene mutation quantitative standard. The invention provides a method for preparing quantitative standard products, and uses fragmented wild type human genome DNA as background DNA, which can better simulate the background of actual detection samples. The calibration method of this quantitative standard is accurate and accurate, and does not depend on DNA standard. The measurement results can be traced back to the international basic unit (quality), so as to ensure the reliability and traceability of the measurement results. This quantitative standard can be used for the method verification and quality control of the KRAS gene mutation detection method.

【技术实现步骤摘要】
KRAS基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法
本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及一种KRAS基因突变检测标准品的制备方法和定值方法。
技术介绍
KRAS(K-ras，p21)基因长度约为35kb，位于12号染色体，编码21kd的ras蛋白。正常的KRAS基因参与细胞内信号传递，当KRAS基因发生突变时，不能产生正常的ras蛋白，会导致细胞内信号传递紊乱，从而导致细胞持续生长不能自我凋亡而引发癌变。在肿瘤患者中检测出的最常见的突变是位于KRAS基因的12、13号密码子的突变。在胰腺癌患者中约有65％～100％的患者是在KRAS基因中携带这些位点的突变，在结直肠癌中携带这些突变的患者约占30％～50％。KRAS基因突变通常会发生在胰腺癌和结直肠癌肿瘤形成的早期。因此，检测体液、胰液或粪便DNA中KRAS基因突变有助于对胰腺癌和结直肠癌患者做出早期诊断。此外，研究表明抗表皮生长因子受体靶向药物(cetuximab和panitumumab)对含有KRAS基因突变的结直肠癌患者无治疗效果。因此，KRAS基因还可以作为一个筛选抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的标志物。目前，检测KR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种KRAS基因突变检测定量标准品的制备方法，包括以下步骤：(1)提取含有KRAS基因突变型的细胞系基因组DNA作为模板，采用普通PCR扩增得到含有目标突变位点的基因片段，通过Sanger测序PCR产物的突变位点的纯度；所述KRAS基因突变型包括G12A、G12D、G12R、G12C、G12S、G12V、G13D；(2)提取野生型人基因组DNA，进行片断化；将7种突变型的PCR产物与片断化的野生型人基因组DNA按照一定比例混匀；(3)添加酵母总RNA至PCR产物与片断化的野生型人基因组DNA混合溶液中。

【技术特征摘要】
1.一种KRAS基因突变检测定量标准品的制备方法，包括以下步骤：(1)提取含有KRAS基因突变型的细胞系基因组DNA作为模板，采用普通PCR扩增得到含有目标突变位点的基因片段，通过Sanger测序PCR产物的突变位点的纯度；所述KRAS基因突变型包括G12A、G12D、G12R、G12C、G12S、G12V、G13D；(2)提取野生型人基因组DNA，进行片断化；将7种突变型的PCR产物与片断化的野生型人基因组DNA按照一定比例混匀；(3)添加酵母总RNA至PCR产物与片断化的野生型人基因组DNA混合溶液中。2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测定量标准品的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，7种突变型的PCR产物与片断化的野生型人基因组DNA混合比例为X1：X2：X3：X4：X5：X6：X7：Y；其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7为0.1～50，Y为50～99.3，且X1+X2+X3+X4+X5+X6+X7+Y＝100。3.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测定量标准品的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所选择的细胞系为可稳定传代的人肿瘤细胞系RPMI-8226、SUN-C2B、NCI-H157、SW1573、A549、SW620、HCT-116。4.根据权利要求1或2所述的KRAS基因突变检...

【专利技术属性】
技术研发人员：董莲华，王晶，王尚君，傅博强，唐治玉，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11