SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公布了一种SHV型超广谱β‑内酰胺酶耐药基因的检测试剂盒，包含特异的引物对和Taqman荧光探针，该试剂盒通过实时荧光定量PCR，能准确地将细菌SHV型超广谱β‑内酰胺酶耐药基因检测出来，指导临床用药，方便快捷，灵敏度高，特异性好。

Detection kit for SHV type extended spectrum beta lactamase resistance gene

The invention discloses a detection kit for SHV type extended spectrum beta lactamase resistance genes, primers containing specific and Taqman fluorescence probe, the kit by real-time quantitative PCR, to accurately bacterial SHV extended spectrum beta detected lactamase resistance genes to guide the clinical medication convenient, fast, high sensitivity, good specificity.

【技术实现步骤摘要】
SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的检测试剂盒
本专利技术涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用实时荧光定量PCR扩增技术(FQ-PCR技术)，快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的试剂盒、引物对及其使用方法。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素(β-lactams)系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。β-内酰胺酶(β-lactamase)的产生是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最常见的机制，是由多种酶组成的酶家族，能水解β-内酰胺类抗生素，在各种耐药机制中占80％，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌。超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，是一类能水解青霉素酶类、头孢菌素类以及单环类抗生素的β-内酰胺酶，能产生ESBL的细菌即为ESBL(+)菌，可对上述多种抗生素产生耐药。根据编码ESBLs基因同源性，可将其分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型等多个类别，每个类别含有多种亚型，且每种类别及其亚型水解药物的特性会有所差别。传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。因而研发一种简便、快速的细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的检测方法具有极大的应用前景。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸快速检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在核酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。本专利技术针对超广谱β-内酰胺酶比较常见和重要的SHV基因型，利用实时荧光定量PCR技术，设计特异性引物和探针，制成细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，并介绍了其使用方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其引物对，以及一种使用该试剂盒快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的试剂盒，包括进行实时荧光定量PCR的PCR反应液，所述PCR反应液含有PCR缓冲液、四种dNTP、耐热DNA聚合酶、一对引物和一条Taqman荧光探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：引物1：5’-GGGAAACGGAACTGAATGAGGC-3’(SEQIDNo.1)；引物2：5’-TCCACCATCCACTGCAGCAG-3’(SEQIDNo.2)；荧光探针：5’-FAM-CCACTACCCCGGCCAGCATGGC-BHQ-1-3’(SEQIDNo.3)。本专利技术用于快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的试剂盒是一种实时荧光定量PCR检测试剂盒，优选的，PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dATP、dUTP、dGTP、dCTP、耐热DNA聚合酶、UNG酶、引物1、引物2和荧光探针。作为优选的，所述PCR缓冲液包含Tris-HCl缓冲液、KCl及PCR增强剂。在PCR反应液中，所述Tris-HCl缓冲液优选浓度为50～100mM，最优选为67mM；所述KCl优选浓度为10～20mM，最优选为13mM；所述PCR增强剂含有下述物质中的一种或多种：二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、硫酸铵，牛血清白蛋白(BSA)、甜菜碱等。作为优选的，所述MgCl2在PCR反应液中的浓度为2～5mM，更优选为3.3mM。作为优选的，所述dATP、dUTP、dGTP、dCTP的浓度为200～300μM，更优选为250μM。作为优选的，所述耐热DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，浓度为0.05～0.2U/μL，更优选为0.1U/μL。作为优选的，所述UNG酶浓度为0.01-0.1U/μL，更优选为0.05U/μL。作为优选的，所述引物1、引物2浓度为1～10μM，更优选为5μM。作为优选的，所述荧光探针浓度为1～5μM，更优选为2μM。进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。作为优选的，所述阳性对照为含有细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因片段的pMD-18T质粒，浓度优选为1000拷贝/μL。所述细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因片段见编号为DQ408259的NCBI序列。作为优选的，所述阴性对照为DEPC水。本专利技术试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。利用本专利技术的试剂盒快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的方法，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，包括如下步骤：(1)提取待检样品DNA；(2)实时定量荧光：利用上述检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增，分别以提取的待检样品DNA、阳性对照和阴性对照为模板，与试剂盒的PCR反应液混合，进行实时荧光定量PCR，检测荧光信号；(3)结果判断：①阳性对照Ct值(thresholdcycle)在25～28之间，阴性对照Ct≥38，进行后续判断，否则应进行问题查找；②待检样品DNA的扩增曲线Ct值≤35为阳性；③待检样品DNA的扩增曲线Ct值≥38为阴性；④待检DNA样品的扩增曲线35＜Ct值＜38，为灰色区域，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。上述步骤(2)中，优选的，每个PCR反应体系的总体积为20μL，其中包括15μLPCR反应液和5μL模板；PCR反应条件通常设置为：50℃2分钟去污染，95℃5分钟预变性，95℃15秒→60℃45秒，FAM通道用于收集检测荧光信号。共40个循环。本专利技术的有益效果是：专利技术针对细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因特异性设计了2条引物和1条Taqman探针，与目的基因的3个区域结合，具有较高的特异性，能准确地将细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因检测出来，指导临床用药。另外，本专利技术的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因，灵敏度高，特异性好，适合临床应用。附图说明图1为实施例4特异性实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1:DEPC，2:TEM，3:CTX-M-1，3:OXA，4:NDM，5:VIM，6:DHA，7:IMP，8:SHV。图2为实施例5灵敏度实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1:DEPC；2～8为含有细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的阳性质粒，浓度依次为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL；9～11为含有细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的阳性质粒，浓度依次为1.0×100、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速检测细菌SHV型超广谱β‑内酰胺酶耐药基因的试剂盒，包括进行实时荧光定量PCR的PCR反应液，所述PCR反应液含有PCR缓冲液、四种dNTP、耐热DNA聚合酶、一对引物和一条Taqman荧光探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：引物1：5’‑GGGAAACGGAACTGAATGAGGC‑3’；引物2：5’‑TCCACCATCCACTGCAGCAG‑3’；荧光探针：5’‑FAM‑CCACTACCCCGGCCAGCATGGC‑BHQ‑1‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测细菌SHV型超广谱β-内酰胺酶耐药基因的试剂盒，包括进行实时荧光定量PCR的PCR反应液，所述PCR反应液含有PCR缓冲液、四种dNTP、耐热DNA聚合酶、一对引物和一条Taqman荧光探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：引物1：5’-GGGAAACGGAACTGAATGAGGC-3’；引物2：5’-TCCACCATCCACTGCAGCAG-3’；荧光探针：5’-FAM-CCACTACCCCGGCCAGCATGGC-BHQ-1-3’。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含Tris-HCl缓冲液、KCl和PCR增强剂。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，在PCR反应液中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50～100mM；所述KCl的浓度为10～20mM。4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR增强剂包含下述物质中的一种或多种：二甲基亚砜、甘油、甲酰胺、硫酸铵，牛血清白蛋白和甜菜碱。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还含有MgCl2和UNG酶。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在PCR反应液中，MgCl2的浓度为2～5mM，UNG酶浓度为0.01-0.1U/μL。7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述耐热DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，浓度为0.05～0.2U/μL；四种dNTP是dATP、dUTP、dGTP和dCTP，浓度各自为200～300μM；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李清宁，严勇，魏颖颖，孙杰，孙利，王磊，倪健，
申请(专利权)人：北京普若博升生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11