RT‑qPCR检测猕猴SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法技术

本发明专利技术提供一种RT‑qPCR检测猕猴

Methods RT qPCR detection of rhesus monkey SLC22A12/URAT1 gene transcription

The invention provides a RT qPCR detection macaque

【技术实现步骤摘要】
RT-qPCR检测猕猴SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
本专利技术涉及一种检测方法，尤其是一种用实时荧光定量法（RT-qPCR）检测猕猴尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A11/URAT1）基因转录水平的方法，属于分子生物

技术介绍
近年来，全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudies，GWAS)已检出多个导致高尿酸血症和痛风的易感位点及相关候选基因。其中SLC2A9、SLC22A11和SLC22A12基因功能缺失性突变可引起遗传性低尿酸血症，而过表达则会加强尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1和SLC17A3基因功能缺陷型变异会降低肾脏和肠道对尿酸的排泄量。尿酸盐阴离子转运体1（urateaniontransporter1，URAT1）是人肾小管重吸收尿酸的主要转运蛋白,是第一个被发现的与肾脏尿酸盐转运的相关蛋白，主要存在于肾小管上皮细胞刷状缘膜上，编码基因为SLC22A11，通过介导尿酸从管腔内利用重吸收作用(管腔两侧的浓度梯度和化学梯度)转运到肾小管上皮细胞，具有强大的尿酸重吸收能力。机体内,尿酸经肾小球滤过、肾小管重吸收、肾小管再分泌及分泌后重吸收4个过程排泄出体外,而原尿中90%的尿酸被近曲小管S1段的URAT1重吸收进入上皮细胞,继而重新进入血液循环，URAT1对近曲小管重吸收起到了关键性的调节作用，抑制URAT1将大大减少尿酸重吸收而促进尿酸排泄。随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯的改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症是人体内嘌呤代谢紊乱致使血液中尿酸增多而引起的一种代谢性疾病，血液尿酸过高可引起痛风、关节组织纤维化甚至坏死、肾功能损伤以及心血管疾病等诸多疾病。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选,还是致病机制的研究,都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。动物模型作为研究疾病发病机制和药理药效的一种方法在科学发展中有着非常重要的作用。探讨高尿酸血症的发病机理和建立动物模型对于攻克高尿酸血症及其并发症尤为重要。猕猴(MacacaMalatta)，又名恒河猴（rhesusmonkey），由于在形态学、生理生化代谢等方面与人类非常相似，是较为理想的实验动物。猕猴的尿酸代谢途径与人类相似，是研究该病的最佳实验动物，研究成果具有极高的转化能力。为了利用人类的近亲——猕猴来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立猕猴尿酸盐阴离子转运体1，即SLC22A12/URAT1mRNA表达的相对定量方法，以研究药物作用猕猴体内SLC22A12/URAT1基因的转录水平变化，进而为研究URAT1功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此,RT-qPCR检测猕猴尿酸盐阴离子转运体1(SLC22A12/URAT1)基因转录水平的方法，对于开展利用动物模型进行的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。目前国内外还未见利用猕猴进行SLC22A12/URAT1基因转录水平定量检测方法的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用实时荧光定量法（RT-qPCR）检测猕猴尿酸盐阴离子转运体1(SLC22A12/URAT1)基因转录水平的方法，以在转录水平上对SLC22A12/URAT1基因进行定量检测。为实现上述目的，本专利技术以待检样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量RT-qPCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量分析SLC22A12/URAT1基因转录水平。本专利技术的具体方案是：一种RT-qPCR检测猕猴SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：猕猴SLC22A12/URAT1基因表达水平的特异性上、下游引物为：SLC22A12/URAT1F：5＇-TCAGCCATGAGGGAGGAAC-3＇SLC22A12/URAT1R：5＇-CCAAAGGCGAACCAGCA-3＇；作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：GAPDHF：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇GAPDHR：5＇-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇；（2）以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的溶解峰单一，说明PCR扩增的特异性好；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDHF和GAPDHR上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2值；当SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段扩增效率分别在80%至120%之间，同时R2接近1时，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求，可进一步进行待检样品检测；（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链作为待测样品c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RT‑qPCR检测猕猴

【技术特征摘要】
1.一种RT-qPCR检测猕猴SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：猕猴SLC22A12/URAT1基因表达水平的特异性上、下游引物为：SLC22A12/URAT1F：5＇-TCAGCCATGAGGGAGGAAC-3＇SLC22A12/URAT1R：5＇-CCAAAGGCGAACCAGCA-3＇；作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：GAPDHF：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇GAPDHR：5＇-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇；（2）以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDHF和GAPDHR上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过q...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐东红，叶尤松，王陈芸，李哲丽，邱炳玲，肖涵，陈倩，杨浩，杨忠，马开利，鲁帅尧，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53