一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液，数字PCR反应缓冲液及检测GBS的特异性引物探针、内标的引物探针；检测方法包括以下步骤：①受检样品处理；②质控品的处理；③配制数字PCR反应混合液；④制作油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。本发明专利技术检测过程无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方法结果判读直观可靠，具有可以稳定实施、精确度高、灵敏度高的特点。

A digital PCR detection kit for detection of GBS and its detection method

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子诊断生物学
，特别涉及一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
GBS(groupBstreptococcus,GBS)正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。如果新生儿带了这种菌，大约有1%～3%会出现早期侵入性感染，其中有5%会导致死亡。早在20世纪70年代GBS就已经被证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。GBS，可在分娩时垂直传播给新生儿，可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。目前国内GBS对35-37周的孕妇和新生儿的筛查，主要是通过细菌培养法、免疫学诊断法、实时荧光PCR法。细菌培养法，采用标准细菌培养方法来检测GBS的存在，取样后大约需要18-48小时得到检测结果，比较费时；免疫学诊断方法，血清学方法不能高通量处理样本。由于窗口期的存在，血清学的诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染；荧光PCR法检测法比较方便，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正荧光对有限的标本材料以及低拷贝数的样本准确性存在一定的限制。因此急需一种更加准确的对GBS进行筛查的试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，以解决无法快速、准确的对新生儿进行B族链球菌筛查的问题。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的上游引物F包括检测GBS的上游引物和内标的上游引物。进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的下游引物R包括检测GBS的下游引物和内标的下游引物。进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的探针P包括检测GBS的探针和内标的探针。进一步的，所述检测GBS的探针及内标探针5’端连接有荧光报告基团，所述检测GBS的探针及内标探针3’端连接有淬灭基团，所述荧光报告基团可选自FAM、CY5、HEX、VIC中任一种，所述淬灭基团均为BHQ。进一步的，所述检测GBS的探针5’端连接FAM荧光报告基团，所述内标探针5’端连接VIC荧光报告基团。进一步的，该试剂盒还包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液。进一步的，所述数字PCR反应缓冲液的组分包括：组分浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）Tris-HCL100mmol/L~200mmol/LKAC20mmol/L~30mmol/LDTT2mmol/L~3mmol/LMgCl25mmol/L~8mmol/L硫酸铵1mmol/L~5mmol/LdNTP100mmol/L~200mmol/LPEG35K2%~5%UDG酶1U/UL~2U/uLTaq酶1U/UL~2U/uL上游引物F20Pmo1/uL~25Pmol/uL下游引物R20Pmo1'uL~25Pmol/uL探针P10PmoluL~15Pmol/uL。进一步的，所述Tris-HCL的pH为6.0~9.0。进一步的，所述Tris-HCL的pH为8.0。一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：①受检样品处理：取新生儿口腔黏液或孕妇阴道分泌物将作为待检测样品，将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5~10分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。②质控品的处理：取所述试剂盒中的GBS阳性质控和阴性质控品，按照与步骤①相同的方法处理，得到GBS阳性质控和阴性质控的DNA模板；③配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样品DNA模板、步骤②处理后得到的GBS阳性质控DNA模板、阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、GBS阳性质控品、GBS阴性质控品的数字PCR反应混合液；④制作油包水PCR微反应液滴：将步骤③制备的样品、GBS阳性质控、GBS阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。进一步的，所述检测GBS的特异性引物对和探针以及内标的引物对和探针序列如下：序号序列（5’→3’）SEQIDNO:1AACCGTCACCTTATTCTAGCASEQIDNO:2GTACTATTGCAGTGGCTAGCTSEQIDNO:3CGAAGCCCAGCAAATGGASEQIDNO:4TACAGGATGCAGAAGGAGASEQIDNO:5GTGGAAGGTGGACAGTGAGSEQIDNO:6TGGATCACATGTGGATTACTGGA相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：①本专利技术用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方法结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，大大提高了检测的灵敏度和精确性。②本专利技术可以检测GBS含量极低的样品检，通过微滴化处理可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，解决了实时荧光定量PCR技术无法精确检测低浓度样本的不足之处。附图说明图1为阳性质控品分析结果图；图2为阴性质控品分析结果图；图3为临床阳性样本分析结果图；图4为临床阴性样本分析结果图；图5为拷贝数为1的样本分析结果；图6为拷贝数为10的样本分析结果；图7为拷贝数为100的样本分析结果。具体实施方式本专利技术提供了一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法。一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：①受检样品处理：取新生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris‑HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的上游引物F包括检测GBS的上游引物和内标的上游引物。3.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的下游引物R包括检测GBS的下游引物和内标的下游引物。4.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的探针P包括检测GBS的探针和内标的探针。5.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测GBS的探针及内标探针5’端连接有荧光报告基团，所述检测GBS的探针及内标探针3’端连接有淬灭基团，所述荧光报告基团可选自FAM、CY5、HEX、VIC中任一种，所述淬灭基团均为BHQ。6.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液。7.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液的组分包括：组分浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）Tris-HCL100mmol/L~...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑园，陈华云，张天海，王盼盼，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44