一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，属于生物检测技术领域。该方法首先首先采集志愿者的唾液，并针对口含型产品的使用特点，模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液总细菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液总细菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考，对于了解口含型烟草制品对口腔健康的影响有一定的指导意义，可根据检测结果提供抑制有害细菌的产品，起到健康保护的作用。

Detection method for influence of oral tobacco products on salivary bacteria

The invention relates to a detection method of a type of oral tobacco products on salivary bacteria, which belongs to the technical field of biological detection. This method firstly collect the saliva, use and characteristics of needle type products containing counterparts, using simulated oral type tobacco products, and the total bacterial content in saliva were analyzed by fluorescence quantitative PCR, to examine the changes in the total bacterial content in saliva before and after using oral type tobacco products, and provide a reference for the joint type of tobacco products oral health, to understand the buccal tobacco product has certain directive significance to the effect of oral health, according to the test results provided inhibit harmful bacteria products to health protection.

【技术实现步骤摘要】
一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法。
技术介绍
Nasidze等通过对全球12个国家和地区的120例健康人群唾液样本进行分析，发现204个细菌基因属，其中39个是以前从没有被描述过的口腔菌属，64个为未知种属。该研究同时发现，口腔细菌组具有个体特异性，但多样性几乎不受地理结构的影响。另有研究采集了特定牙位的龈上菌斑和龈下菌斑以及唾液等26种样本并将其混合，鉴定出9个门的247种细菌，这些细菌在种和株水平上存在明显的个体差异，与肠道细菌在属的水平上存在显著的差异。有研究者将核心微生物按丰度高低依次排列为：链球菌属(25％)、普雷沃菌属(16％)、嗜血杆菌属(12％)、罗思菌属(7％)、韦荣球菌属(6％)、奈瑟菌属(6％)、梭杆菌属(6％)和卟啉菌属(4％)。研究者认为当口腔内环境发生变化时，原有的口腔微生态平衡受到破坏形成新的生态环境或滞留区，对口腔内定居微生物会产生影响，口腔微生物的种类、数量、微生物与微生物之间、微生物与宿主之间的相互关系均发生变化，这些变化都可能会导致基牙产生龋病和牙周病变。因此口腔相关微生物的变化是口腔微环境的重要指标之一。口含型无烟气烟草制品是一种湿润的烟草粉末制品，起源于19世纪瑞典。瑞典口含烟产品呈现细的颗粒状，含水量通常在40％以上，含水量低于40％的半干制品也有售。产品放在上唇与牙龈之间，使用时不需要唾出唾液，有散装和袋装产品。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中唾液总细菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，该方法首先首先采集志愿者的唾液，并针对口含型产品的使用特点，模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液总细菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液总细菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采集健康志愿者唾液；步骤(2)，采用步骤(1)采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌DNA，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA；步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制荧光定量PCR标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌DNA作为模版进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量PCR反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为FAM-cacggtgaatacgttcccgggc-TAMRA。进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤(1)采集的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液。进一步，优选的是，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。进一步，优选的是，步骤(3)的具体方法为：(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)采集到的唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；(3.2)培养液中的唾液总细菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5％；(3.3)多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108CFU/mL，离后，弃上清，加入体积是混合物体积5％的微生物PCR裂解液，在75-85℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA；所述的微生物PCR裂解液为LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR。进一步，优选的是，口腔细菌标准菌株的混合物中包括变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、放线菌中的至少一种。进一步，优选的是，(3.2)中培养液的离心的转速为11000-12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为1min。进一步，优选的是，(3.3)中，混合物的离心的转速为11000-12000r/min，时间为5min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为10s。进一步，优选的是，在进行荧光定量PCR分析前需要对多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA、各时间点培养液中唾液总细菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。进一步，优选的是，步骤(4)的具体方法为：向多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始DNA体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；取各培养液中的唾液总细菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；荧光定量PCR反应体系：荧光定量PCR试剂盒中的MasterMix(2X)Kit10μL，共20μL；荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；之后绘制唾液总细菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量。进一步，优选的是，荧光定量PCR分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术提供了一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，为口含型烟草制品对口腔健康的影响提供参考。本专利技术采用了荧光定量PCR方法对唾液总细菌进行分析，可实时定量跟踪唾液中微生物含量的变化，保证了试验的准确性及高效性。同时设计了3个动态唾液采集点及咀嚼后3个共培养时间段，动态唾液采集点以模拟人在使用口含型烟草制品时的动态过程，共培养时间段以模拟人在咀嚼后的口腔静态过程，使检测更为全面精确。本专利技术可模拟人使用口含型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采集健康志愿者唾液；步骤（2），采用步骤（1）采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；步骤（3），将步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌DNA，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA；步骤（4），以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制荧光定量PCR标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌DNA作为模版进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量PCR反应所使用的上游引物为5’‑ cgctagtaatcgtggatcagaatg‑3’；下游引物为5’‑tgtgacgggcggtgtgta‑3’；探针为FAM‑cacggtgaatacgttcccgggc‑TAMRA。

【技术特征摘要】
1.一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采集健康志愿者唾液；步骤（2），采用步骤（1）采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；步骤（3），将步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌DNA，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA；步骤（4），以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制荧光定量PCR标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌DNA作为模版进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量PCR反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为FAM-cacggtgaatacgttcccgggc-TAMRA。2.根据权利要求1所述的口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（2）的具体方法为：向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤（1）采集到的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液。3.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，其特征在于，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。4.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法为：（3.1）共培养：取步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）采集到的唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；（3.2）培养液中的唾液总细菌DNA的提取：取出步骤（3.1）的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5%；（3.3）多种口腔细菌标准菌株混合物的原始DNA的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108CFU/mL，离后，弃上清，加入体积是混合物体积5%的微生物PCR裂解液，在75-85℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高茜，米其利，朱洲海，管莹，陆舍铭，徐玉琼，李雪梅，夭建华，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53