一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明专利技术采用生物化学及细胞学方法，利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP‑5 mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

A method for detecting the effect of cigarette smoke on the expression of mRNA in aquaporin 5 cells

The invention relates to a method for detecting the influence of cigarette smoke on the expression of mRNA in water channel protein 5 cells, which belongs to the field of biological application technology. The invention adopts the biochemical and cytological methods, treatment of cells with BMP6, simulation of the drying syndrome occurs when the cell microenvironment of cigarette smoke on the expression of AQP 5, compared to the experimental animal is more simple and efficient; in cigarette smoke trapping using oral bionic simulation device, human aspiration the state is more practical; at the same time using fluorescence quantitative PCR method, real-time comparison of different samples of AQP 5 mRNA expression, which provides a rapid means for the effectiveness evaluation of cigarette smoke.

【技术实现步骤摘要】
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法
本专利技术属于生物应用
，具体涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法。
技术介绍
唾液是维持口腔微生态环境平衡的主要因素，具有湿润口腔和食物、便于说话吞咽、移走味蕾上的食物微粒，从而不断尝到食物上的味道以及清洁和保护口腔等多种作用。卷烟感官评价表明部分卷烟烟气会引起口腔干涩、燥刺、不适等负面感受，因此研发具有降燥生津功能的卷烟产品，对于改善口腔舒适感提升卷烟抽吸品质具有重要意义。水通道蛋白家族(Aquaporins,AQP)是特异性跨膜转运水的一组蛋白，能显著增加细胞膜水通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。AQP5是一种主要表达于唾液腺及皮肤小汗腺的水通道蛋白，主要介导水分子跨细胞膜通透转运，在唾液分泌中起着重要作用。研究表明干燥综合症患者及干燥综合症模型小鼠涎腺细胞中存在AQP5的下调或亚细胞分布异常，因此恢复腺体内AQP5的正常亚细胞分布、上调AQP5成为治疗干燥综合症的可能手段。目前，医学上化学物质对水通道蛋白的影响大多是通过干燥综合症动物模型进行整体动物水平的AQP5研究，不适用于大批量样品的检测。因此如何通过细胞分子生物学方法来进行卷烟烟气对水通道蛋白影响检测对生津物质的开发起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，该方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境，从而研究卷烟烟气对AQP-5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤(2)，将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25％胰酶消化后，以2-4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5％CO2的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；步骤(3)，移去步骤(2)中的培养上清，以步骤(1)得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5％CO2的条件下对细胞进行培养22-26h；仿生抽吸液体的用量与细胞之间的比例没有限制，按照培养基的常用量使用即可；步骤(4)，培养结束后弃上清，用0.25％胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；步骤(5)，采用步骤(4)得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；步骤(6)，采用步骤(5)中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBRGreen法操作进行荧光定量PCR实验；PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix10μL、ddH2O6.8μL、上游引物200nmol/L0.4μL、下游引物200nmol/L0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’(SEQIDNO.1)，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’(SEQIDNO.2)；内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’(SEQIDNO.3)，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’(SEQIDNO.4)；步骤(7)，数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。进一步，优选的是，步骤(1)所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2％，时间48h。进一步，优选的是，步骤(1)所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。进一步，优选的是，步骤(1)所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。进一步，优选的是，步骤(1)中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的DMEM/F12细胞培养基的量为5mL。进一步，优选的是，培养均在培养板中进行。进一步，优选的是，步骤(2)和步骤(4)消化细胞的时间均为1-2min。进一步，优选的是，在进行逆转录前需要对RNA的纯度进行判定，判定方法是：将待测样品的RNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.8～2.1时，表明纯度合格，能进行逆转录，反之，则表明纯度不合格，不能进行逆转录。进一步，优选的是，每个样品检测均重复三次，水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量取其平均值。抽吸时，全自动转盘式吸烟机连接在装置的烟气进气管上。若有多个样品间比较，需将RNA浓度调成一致，优选采用超纯水调节浓度。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术采用生物化学及细胞学方法，建立了一种卷烟烟气对细胞水通道蛋白mRNA表达量影响的检测方法，该方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP-5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效，将实验周期从几个月缩短至几天；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP-5mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。1.实验材料：涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83细胞)从ATCC购买。2.主要实验器材：ABIQuantStudio7FlexReal-TimePCRSystem(美国ThermoFisherScientific公司)；CO2培养箱(Thermo公司)；二级生物安全柜(HealForce公司)；倒置显微镜(TS100-F-HMC型，Nikon公司)；96孔板、细胞培养瓶(美国Corning公司)。本专利技术提取细胞总RNA用TIANGEN公司的培养细胞总RNA提取试剂盒进行提取；逆转录PCR合成cDNA时采用TaKaRaClontech公司的逆转录试剂盒进行PCR。实施例1一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10‑20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2‑4×10

【技术特征摘要】
1.一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2-4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5%CO2的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22-26h；步骤（4），培养结束后弃上清，用0.25%胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；步骤（5），采用步骤（4）得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；步骤（6），采用步骤（5）中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBRGreen法操作进行荧光定量PCR实验；PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix10μL、ddH2O6.8μL、上游引物200nmol/L0.4μL、下游引物200nmol/L0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火／延伸60℃30s，共40个循环；AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcc...

【专利技术属性】
技术研发人员：高茜，刘欣，黄海涛，向海英，李雪梅，孔维松，杨光宇，夭建华，李晶，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53