一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明专利技术采用生物化学及细胞学方法，利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP‑5 mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

A method for detecting the effect of cigarette smoke on the expression of mRNA in aquaporin 5 cells

The invention relates to a method for detecting the influence of cigarette smoke on the expression of mRNA in water channel protein 5 cells, which belongs to the field of biological application technology. The invention adopts the biochemical and cytological methods, treatment of cells with BMP6, simulation of the drying syndrome occurs when the cell microenvironment of cigarette smoke on the expression of AQP 5, compared to the experimental animal is more simple and efficient; in cigarette smoke trapping using oral bionic simulation device, human aspiration the state is more practical; at the same time using fluorescence quantitative PCR method, real-time comparison of different samples of AQP 5 mRNA expression, which provides a rapid means for the effectiveness evaluation of cigarette smoke.

【技术实现步骤摘要】
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法
本专利技术属于生物应用
，具体涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法。
技术介绍
唾液是维持口腔微生态环境平衡的主要因素，具有湿润口腔和食物、便于说话吞咽、移走味蕾上的食物微粒，从而不断尝到食物上的味道以及清洁和保护口腔等多种作用。卷烟感官评价表明部分卷烟烟气会引起口腔干涩、燥刺、不适等负面感受，因此研发具有降燥生津功能的卷烟产品，对于改善口腔舒适感提升卷烟抽吸品质具有重要意义。水通道蛋白家族(Aquaporins,AQP)是特异性跨膜转运水的一组蛋白，能显著增加细胞膜水通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。AQP5是一种主要表达于唾液腺及皮肤小汗腺的水通道蛋白，主要介导水分子跨细胞膜通透转运，在唾液分泌中起着重要作用。研究表明干燥综合症患者及干燥综合症模型小鼠涎腺细胞中存在AQP5的下调或亚细胞分布异常，因此恢复腺体内AQP5的正常亚细胞分布、上调AQP5成为治疗干燥综合症的可能手段。目前，医学上化学物质对水通道蛋白的影响大多是通过干燥综合症动物模型进行整体动物水平的AQP5研究，不适本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10‑20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2‑4×10

【技术特征摘要】
1.一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2-4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5%CO2的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22-26h；步骤（4），培养结束后弃上清，用0.25%胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；步骤（5），采用步骤（4）得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；步骤（6），采用步骤（5）中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBRGreen法操作进行荧光定量PCR实验；PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix10μL、ddH2O6.8μL、上游引物200nmol/L0.4μL、下游引物200nmol/L0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火／延伸60℃30s，共40个循环；AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcc...

【专利技术属性】
技术研发人员：高茜，刘欣，黄海涛，向海英，李雪梅，孔维松，杨光宇，夭建华，李晶，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53