本发明专利技术公开了一种检测BRAF基因突变的方法及其试剂盒，其方法包括：1）同时进行A、B和C管反应，对已知突变量的质粒标准品进行关于BRAF基因的V600E和V600K突变的实时定量PCR检测，得出标准曲线；2）提取、纯化样品DNA，测定其浓度，按照步骤1）的A、B和C管反应体系进行样品的实时定量PCR检测，并根据标准曲线以及扩增荧光信号，判别基因突变存在和突变量；该试剂盒包括：用于检测BRAF基因第15号外显子突变V600E和V600K的引物对、探针、PNA阻遏序列。本发明专利技术使BRAF基因第15号外显子突变V600E和V600K检测更为准确，大大提高了检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别是涉及一种检测BRAF基 因突变的方法及其试剂盒。
技术介绍
结直肠癌发病率逐年增高，晚期及术后复发患者需要生物靶向治疗。美国FDA 及我国结直肠癌术后治疗方案中明确指出，在进行一线和二线化疗方案实施中，拟加入靶 向EGFR受体抗体靶向药物(西妥昔单抗和帕尼单抗）时，需进行药敏基因突变检测。国 际大样本多中心研究表明，同时进行KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因突变检测，并按此顺 序串联诊断，可最大限度地准确预测患者对于抗体靶向药物的敏感性(参见文献Roock WDjClaes BjBernasconi D et al. Effects of KRAS, BRAFj NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol，2010, 11:753-62.)。 目前针对BRAF基因突变的检测方法主要有：直接测序法（Direct Sequencing)、 高分辨率溶解曲线分析技术（high resolution melting analysis，HRM)和扩增阻滞突 变系统技术（amplification refractory mutation system，ARMS)。直接测序法（Direct Sequencing)以PCR扩增技术为核心，其灵敏度较低大于10%，有碍其临床广泛应用（参 考文献 Lynch Tj Bell D，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non - small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med，2004, 350 (21) :2129-2139. Paez J，Janne P，Lee J，et al. EGFR mutations in lung cancer:Correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science，2004, 304 (4) : 1497-1500.)。高分辨率溶解曲线分析技术 (high resolution melting analysis，HRM)是利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列 溶解曲线不同的原理，在PCR扩增后根据扩增产物的熔点不同完成对样品突变分析，其灵 敏度可达1%，但需要高灵敏度的精密Q-PCR仪，多用于研究中，限制了其临床应用（参考文 献 Li LHj Tze KEj Chih CCj et al. Characteristics and prevalence of KRAS, BRAFj and PIK3CA mutations in colorectal ancer by high-resolution melting analysis in Taiwanese population. Clinica Chimica Acta，413 (2012) 1605 - 1611) ?扩增阻滞突变 系统技术（amplification refractory mutation system，ARMS)是设计引物 3'端序列 分别野生和突变互补，针对突变的等位基因进行特异性扩增和鉴定。另外Scorpions为 蝎形结构的特异性探针，包含一个与Y端共价相连的PCR引物，引物仅仅识别突变序 列，而不识别正常序列，在即时PCR反应中，当探针与扩增子（即突变序列）连接进行扩增 时，荧光基团与淬灭基团分离，反应试剂中荧光度增强。Scorpions与ARMS技术联和应 用（SARMS)可检测单个突变，对于已知基因的检测，SARMS具有高度的敏感性0.1%。该方 法的缺点是：1)每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定；2)可能 出现由于单一碱基错配造成的假阳性。该方法主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜 检组织类，2小时即可完成检测，试剂盒商业化程度高，临床认可程度高，国内已有试剂盒 获 SFDA 生产批文【参考文献 Newton CR，Graham A，Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA: the amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acids Res, 1989, 17(7):2503-2516. Marcin M. Machnicki, Eliza GM1Tomasz L, et al. ARMS-PCR for detection of BRAF V600E hotspot mutation in comparison with Real-Time PCR-based techniques. ACTA BIOCHIMICA POLONICA, VoI. 60, Nol/2013:57 - 64.Fox JC, et al. The detection of K~ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system, Br J Cancerl998;77:1267-74. ]〇 肽核酸是一种DNA类似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯 糖，其较之传统DNA探针具有不少优点：1) PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性 远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被 其他酶所降解。2)对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度 下降9 一 KTC左右。目前，肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具已在疾病的诊断、 治疗等领域得到应用（参见文献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006 ;9 :62-68 ;Egholm M， et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature, 1993, 365:566 ~568.)。韩国 PANAGENE 公司和美国 PNA Bio Inc.公司均应用PNA作为钳制探针，阻遏野生DNA序列的扩增，使突变序列得以扩增检 测，用于突变序列的筛查，研制了 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一对用于检测BRAF基因第15号外显子突变V600E和V600K的引物对，其特征在于，包括：1）如SEQ ID NO.1所示的上游序列和如SEQ ID NO.2所示的下游序列；或者2）至少与SEQ ID NO.1所示的上游序列80%相同的序列和至少与SEQ ID NO.2所示的下游序列80%相同的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李跃，高小祐，孙景凤，
申请(专利权)人：李跃，高小祐，孙景凤，
类型：发明
国别省市：上海;31
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