一种基因点突变的实时PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因突变检测领域，具体涉及一种基因点突变的实时PCR检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变；其中双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物；本发明专利技术重复性好，筒单，快速，只需很少量的DNA样品(2-3ng)，特别适用于大量样品检测，本方法的另外一个最重要的特点是不会引起PCR产物的污染，可以极大地降低运作成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基因点突变的检测方法。
技术介绍
随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变(有义突变)等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA(目的DNA)含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。在过去十多年中，曾出现了多种点突变的检测方法。1.经典的PCR-RFLP等点突变的检测方法。RFLP连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法，其检测特点是:具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测:即突变频率大于I %才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。2.反向限制性位点突变分析(iRSM):在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量(一般消化率> 99% )，因而大大提高了突变序列的检出率。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。3.基因芯片具有检测信息高通量和自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力，但制备技术要求高。 4.DNA 测序Sanger DNA测序是点突变检测的金标准。但Sanger测序灵敏度低，测序准备时间长。另一个方法是焦磷酸测序，它的特点是准备时间短，测序也快。但是这两种方法都需要对PCR产物处理，需要非常小心地防止产物污染。5.等位基因特异性扩增一个引物的3’端与特定的突变碱基相配，特异性扩增这一突变的片断，灵敏度高，但一个反应只能检测一个突变。比如Therascreen KRAS RGQ PCR Kit，每个样品做8个PCR反应，也只能检测7个常见的突变，而KRAS在密码子12，13上可能的突变是12个。6.等位基因区别实时PCR在PCR反应中有两个特异的探针，区别野生型和突变型，灵敏度和特异性都低于特异性扩增，也是一个反应测定一个突变。7.荧光PCR检测点突变SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙唆、Y0-PR0-1[—样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出。突光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer, FRET)结合探针熔解曲线分析点突变。通过对杂交产物稳定性进行实时监测，并结合熔解曲线分析，提高了对点突变检测的分辨率SYBR Green I法和FRET法对点突变的检测均依赖于熔解曲线分析，但存在着诸多限制条件，即:①熔解曲线的相对位置和宽度与所加入的染料浓度及温度转换率相关。在分子生物学基因点突变的研究中，仍需加强研究，克服上述各方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、简单、成本低，无PCR产物污染的风险，适用于大批量样品的检测，可以精确定位突变位点，所需的DNA样品量少的基因点突变检测方法。为实现上述放目的，本专利技术采用如下技术方案:一种基因点突变的实时PCR检测方法，包括以下步骤(I)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。本方法使用LightCycIer仪器和LightCycler双杂交探针。LC仪器激发光只能激发Fluorescein,而L C突光色团只能被Fluorescein发出的光激发。本放的基因点突变的实时PCR检测方法，所述的DNA扩增循环使用由上游探针和下游探针组成的双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一 LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物。引物位于突变点两侧，LC的双杂交探针头尾串联，仅相隔一，二个核苷酸。本专利技术的实时PCR检测方法，所述的DNA扩增循环包括:1)聚合酶被激活、样品DNA变性双链分开成两条单链。2)接着温度下降至使DNA退火，3)引物联合在样品DNA单链上形成双链，聚合酶以样品DNA为模板开始合成，同时双杂交探针也在其中一条样品单链上；4)上游探针的尾端和下游探针头端靠近，发生荧光共振能量传递，LC机器发光激活Fluorescein, Fluorescein发光激活LC突光色团,LC突光色团发出的光被机器纪录。5)然后温度升至72°C左右，在这个温度下，杂交探针已变性离开杂交位置，聚合酶快速合成DNA形成两条双链，6)温度又上升至90-95°C，扩增开始第二轮循环。本专利技术的实时PCR检测方法，I)所述的聚合酶被激活是在95°C高温10分钟，所述DNA退火温度，52 58°C。用于PCR检测的样品DNA，稀释至5_20ng/ul。反应试剂中的多聚酶是热启动的DNA聚合酶，提高扩增的特异性。用解链曲线检测基因突变。本专利技术的实时PCR检测方法，(2)所述的解链曲线分析程序包括升高温度变性扩增的DNA，降低温度让探针与单链DNA杂交，然后缓慢升高温度让探针与扩增的DNA片断变行解链。本专利技术的实时PCR检测方法，其特征在于，变性扩增的DNA温度为95°C，退火让探针与单链DNA杂交的温度为40°C，LC荧光色团被激发发光。然后很缓慢地加热探针扩增片断杂交体，机器开始连续记录荧光强度。温度上升到一定程度使一条探针变性离开原来的位置，两个荧光团分开，荧光共振能量传递消失，LC荧光色团不发光。在一个温度点，半数杂交体上的探针离开扩增的片断，这就是这个探针的解链温度。所述让探针与扩增的DNA片断变性解链的温度由荧光(F)和温度(T)的负导数(-dF/dT)确定。设计时覆盖突变点的探针是匹配野生型的。确定长度和序列的探针在确定反应条件下，解链温度是一定的，波动小于rc。本专利技术的实时PCR检测方法，(3)所述判定所测基因有无突变是根据探针解链的温度来判定:如果有突变，突变点的一个或两个碱基改变了，与探针相应碱基不匹配，探针与突变型的杂交能力下降，低于野生型的解链温度就能使它变性分离。用解链曲线分析，突变型基因的解链温度会发生左移，比野生型低3°C，杂合基因有两个解链温度峰；无突变，解链温度不发生左移，有一个解链温度峰。本专利技术的实时PCR检测方法，其特征在于，扩增片断要大于150bps，福尔马林固定石蜡包埋的组织约200bps，血液或新鲜组织可以大至300bps。LC机器温度变化快，达到20°C /秒，加上LC双杂交探针，LC实时PCR特异性高。实时PCR和曲线分析反应在玻璃毛细管中进行，反应体积可少至10ul，试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。

【技术特征摘要】
1.一种基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。2.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(I)所述的DNA扩增循环使用由上游探针和下游探针组成的双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一 LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在弓I物的下游尽量靠近另一个弓I物。3.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，⑴所述的DNA扩增循环包括:1)聚合酶被激活、样品DNA变性双链分开成两条单链。2)接着温度下降至使DNA退火，3)引物联合在样品DNA单链上形成双链，聚合酶以样品DNA为模板开始合成，同时双杂交探针也在其中一条样品单链上；4)上游探针的尾端和下游探针头端靠近，发生荧光共振能量传递，5)然后温度升至72°C左右，在这个温度下，杂交探针已变性离开杂交位置，聚合酶快速合成DNA形成两条双链，6)温度又上升至90-95°C，扩增开始第二轮循环。4.根据权利要 求3所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，I)所述的聚合酶被激活是在95°...

【专利技术属性】
技术研发人员：周耐明，
申请(专利权)人：镇江盛泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：