一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，特别地，涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其用于检测骨肉瘤的应用。本发明专利技术所述荧光定量PCR检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对骨肉瘤风险的风险值来计算骨肉瘤风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的骨肉瘤风险级别，从而评估受检者的骨肉瘤风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明专利技术通过对选定的5个基因多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的骨肉瘤评估奠定了基础。

A fluorescence quantitative PCR detection system for osteosarcoma gene screening and its application

The invention relates to the field of biological detection technology, in particular to a fluorescence quantitative PCR detection kit, and further discloses its application in detecting osteosarcoma. The fluorescence quantitative PCR detection system, including the detection kit of specific genes, and to calculate the risk according to the risk of osteosarcoma per locus on osteosarcoma risk score value, and to make people graded according to the existing database, get the risk level of osteosarcoma by individual individual scores, to evaluate the flesh tumor risk subjects, leading to high risk to improve the way of life, and to avoid inducing factors and increase the frequency of physical examination. At the same time, the Chinese database was established by selecting 5 polymorphic loci, which laid the foundation for establishing the evaluation of osteosarcoma in Chinese population.

【技术实现步骤摘要】
一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用
本专利技术涉及生物检测
，特别地，涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其用于检测骨肉瘤的应用。
技术介绍
随着科学研究的不断发展，尤其是人类基因组计划完成后，后基因组计划的全面展开，以基因检测为主导的最新技术在疾病防控领域的应用得到广泛的关注。目前运用遗传学的理论和方法进行疾病风险预测已经有了初步进展，常用的基因检测方法包括：直接测序法(directsequencing，DS)、连接酶检测反应法(ligasedetectionreaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析法(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析法(denaturinghighperformanceliquidchromotography，DHPLC)、以及定量PCR检测法，其中，利用DNA分析仪进行直接测序是金标准，但是该方法却存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等诸多问题。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem，qPCR)，又称实时定量基因扩增荧光检测系统、荧光定量PCR(realtimePCR)检测技术，是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR系统为第三代的PCR检测技术，具有检测灵敏度高、检测线性范围宽、检测精度和重复性好等突出优势，并因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，可以高效、准确的用于运动基因检测。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，这种变异包括转换、颠换、缺失和插入，进而形成的遗传标记，其数量很多且多态性丰富。SNP为第三代遗传标志，人体许多表型的差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，因此SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在人类基因组中分布相当广泛，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个，甚至更多研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现其与包括肿瘤相关基因组突变在内的各种疾病，且从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系研究来得容易。虽然有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，进而也成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，并通过对Y染色体SNP的分析，使得其在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域都取得了一系列重要成果。已有越来越多的文献对荧光定量PCR技术从各方面的应用角度进行阐述，大部分文献公开了多种单一片段通过荧光定量PCR技术进行检测的具体方式方法，但在专利技术人进行荧光定量PCR检测SNP位点的过程中，发现单一片段的检测不足以满足检测要求，对于具有两个或多个SNP位点的综合性检测，需要重复检测，步骤繁琐且操作时间长。骨肉瘤是成人和儿童最常见的一种非血源性的骨恶性肿瘤，占原发性恶性骨肿瘤的20％左右，且多起源于骨间叶组织。典型的骨肉瘤好发于长管状骨干骺端，且通常预后不佳、恶性程度高，早期极有可能发生肺转移，约有10-20％的病人在诊断时发现有转移灶，仅约10％的病人在治疗后具有较长时间的无症状期。骨肉瘤典型的组织学特点是易产生恶性细胞的类骨样物质，与骨肉瘤相关的遗传和表观遗传学改变已有大量报道，但仍没有达成共识。随着对干细胞生物学和癌症干细胞相关知识的逐渐了解，越来越多的证据表明骨肉瘤可能是一个与干细胞分化有关的疾病，且由多潜能干细胞逐渐分化形成的成骨细胞再继续分化成熟为骨细胞的过程，是一个受到一系列信号传导通路精密调节的过程。很多分子水平的变化强烈的提示我们，是遗传和表观遗传学的因素干扰这一分化过程，继而诱发骨肉瘤。虽然目前关于骨肉瘤的治疗手段主要局限于抑制骨肉瘤的增殖，但是促进其分化和/或规避分化障碍很有可能是一种有效的辅助治疗手段。但由于骨肉瘤发生的分子机制尚未阐明，且一些基因的异常表达可以增加骨肉瘤发病的易感性，如患有遗传性视网膜母细胞瘤的病人、Paget’s病的病人都是骨肉瘤的好发人群。细胞遗传学对骨肉瘤的研究显示，骨肉瘤具有多种遗传的改变，导致了多种肿瘤抑癌基因的失活以及癌基因的过表达。其中，RB基因、P53基因以及Kras基因的异常与骨肉瘤的发生密切相关。并且现有数据也表明，骨肉瘤存在着大量遗传和分子水平的改变，包括染色体增加、减少或染色体区域重组所致的肿瘤抑制基因失活，以及主要信号通路失衡等。现有的骨肉瘤相关的基因位点是基于欧洲人群大样本量GWAS研究得出的强关联位点，在应用于亚洲人群，尤其是我国人群时，位点关联性较弱，难以通过检测得到较为准确的结果，因此建立中国人群的评估系统是十分有必要的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其在骨肉瘤基因筛查领域的应用。为实现上述目的，本专利技术提出了荧光定量PCR检测系统用于制备骨肉瘤基因筛查系统的用途。本专利技术还公开了一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测试剂盒，以及检测结果对照评价系统；所述检测结果对照评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库；所述荧光定量PCR检测试剂盒包括对至少两个骨肉瘤相关基因位点检测的荧光定量PCR检测试剂。所述荧光定量PCR检测的相关位点包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。检测所述骨肉瘤基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中，待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为Pa，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：Pa+0.6S≤P为高风险级别；Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为偏高风险级别；Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为偏低风险级别；P＜Pa-0.6S为低风险级别。更进一步的，所述平均方差S的计算方式如下：其中，i为待测基因的检测位点数量；平均风险值Pa为通过东亚人群的基因组数据，Pa的计算公式为：其中，人群总人数为N。本专利技术还公开了所述的荧光定量PCR检测系统在骨肉瘤基因筛查领域中的应用。本专利技术还公开了一种基于荧光定量PCR法筛查骨肉瘤基因的方法，包括利用所述的荧光定量PCR检测系统对骨肉瘤相关基因进行荧光定量PCR检测的步骤，所述荧光定量PCR检测的位点包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。更优的，所述的利用荧光定量PCR法检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
荧光定量PCR检测系统用于制备骨肉瘤基因筛查系统的用途。

【技术特征摘要】
1.荧光定量PCR检测系统用于制备骨肉瘤基因筛查系统的用途。2.一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测试剂盒，以及检测结果对照评价系统；所述检测结果对照评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库；所述荧光定量PCR检测试剂盒包括对至少两个骨肉瘤相关基因位点检测的荧光定量PCR检测试剂。3.根据权利要求2所述的用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的相关位点包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。4.根据权利要求3所述的用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，检测所述骨肉瘤基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：5.根据权利要求2-4任一项所述的用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。6.根据权利要求2-5任一项所述的用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中，待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为Pa，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：Pa+0.6S≤P为高风险级别；Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为偏高风险级别；Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为偏低风险级别；...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴少鸿，周文根，李欣，姜萍萍，黄君，任飞，詹延延，赵世林，李政，
申请(专利权)人：深圳美因医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：广东,44