The invention relates to an extraction method of total RNA excretion, pertains to the field of extracting bioactive substances. In order to overcome the defects of the prior art, the invention aims to provide a method for extracting total RNA excretion. The method of extraction steps of exosomes and exosomes in RNA include ultracentrifugation, extraction of samples obtained after testing including 18S and 28sRNA, the content is higher, extraction method is feasible, suitable for popularization and application.
【技术实现步骤摘要】
一种外泌体总RNA的提取方法
本专利技术涉及一种外泌体总RNA的提取方法,属于生物活性物质提取领域。
技术介绍
当外泌体在1980年首次被发现后,其被认为是细胞排泄废物的一种方式,如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换,从而导致大量新生血管的生成,促进了肿瘤的生长与侵袭。人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体,包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时,外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式:一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合,进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中,外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切,剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合,从而激活细胞内的信号通路。有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合,非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及microRNA。中国专利技术专利申请CN201610021424.5公开了一种血清外泌体中RNA的提取方法,其包括以下步骤:1)提取血清中的外泌体;2)在超声的作用下使用RNA提取试剂裂解步骤1)中提取的外泌体;3)使用氯仿分离步骤2)中裂解后的外泌体的RNA至水相;4)使用异丙醇沉淀步骤3)得 ...
【技术保护点】
一种外泌体总RNA的提取方法,其包括如下步骤:1)利用超速离心法提取外泌体:将样本在300xg,4℃下离心10min,吸取上清在2000xg,4℃下离心10min,吸取上清在10000xg,4℃离心30min;吸取上清在100000xg,4℃离心70min,去除上清,保留沉淀,向沉淀中加入1xPBS缓冲液重悬,在100000xg,4℃下离心70min,去除上清后的沉淀即为外泌体;2)外泌体中RNA的提取:A.向外泌体中加入140μl1xPBS缓冲液重悬保存得到外泌体保存液,向外泌体保存液中加入700μl的QIAzol Lysis Reagent,使用移液枪吹打混匀,室温条件下静置5~10min,向其中加入140μl的氯仿,温和颠倒混匀将混合液在室温条件下静置2~3min;将混合液在12000xg,4℃离心15min,离心结束后液体分层,吸取上层水相RNA层到离心管;B.向其中加入1.5倍体积的无水乙醇,吹打数次混匀后转移700μl混合液到离心收集管中,套上2ml收集管,≥8000xg,室温条件下离心15s,重复B步骤,直到所有液体都进行一次过柱;C.向其中加入700μl Buffer ...
【技术特征摘要】
1.一种外泌体总RNA的提取方法,其包括如下步骤:1)利用超速离心法提取外泌体:将样本在300xg,4℃下离心10min,吸取上清在2000xg,4℃下离心10min,吸取上清在10000xg,4℃离心30min;吸取上清在100000xg,4℃离心70min,去除上清,保留沉淀,向沉淀中加入1xPBS缓冲液重悬,在100000xg,4℃下离心70min,去除上清后的沉淀即为外泌体;2)外泌体中RNA的提取:A.向外泌体中加入140μl1xPBS缓冲液重悬保存得到外泌体保存液,向外泌体保存液中加入700μl的QIAzolLysisReagent,使用移液枪吹打混匀,室温条件下静置5~10min,向其中加入140μl的氯仿,温和颠倒混匀将混合液在室温条件下静置2~3min;将混合液在12000xg,4℃离心15min,离心结束后液体分层,吸取上层水相RNA层到离心管;B.向其中加入1.5倍体积的无水乙醇,吹打数次混匀后转移700μl混合液到离心收集管中,套上2ml收集管,≥8000xg,室温条件下离心15s,重复B步骤,直到所有液体都进行一次过柱;C.向其中加入700μlBufferRWT,≥8000xg,室温离心15s,加入500μl的BufferRPE,≥8000xg,室温离心15s,再次加入500μl的BufferRPE,≥10000xg,室温离心2min,将吸附柱套于一个新的2ml收集管中,全速离心1min,去除收集管;将吸附柱转移到一个1.5ml离心管中,打开盖子,室温风干3~5min;加入24~40μl的DEPC水或无RNas...
【专利技术属性】
技术研发人员:罗伟全,郑壮武,董少玲,
申请(专利权)人:广州华银医学检验中心有限公司,广州华银健康科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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