用于纯化质粒DNA的方法和试剂盒技术

本公开涉及用于核酸纯化的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。本文还公开了包含这些缓冲液和磁性颗粒的试剂盒。

Method and kit for purifying plasmid DNA

The invention relates to a method for purification of nucleic acids, the method comprises (a) will contain at least one sample of nucleic acid and suspension buffer combined to form suspension (b) will be formed with the lysate suspension with lysis buffer (c) of the lysates with binding buffer combine to form a solution; (D) will be combined with the solution with at least one of the magnetic particles to form a combined solution, the magnetic particles with a solution comprising at least one modified with at least one reversible nucleic acid, (E) combined with magnetic particles in solution separation of the at least one modified from the magnetic particles (f) with the first washing buffer and second washing buffer of the at least one modification, and (g) at least one kind of magnetic particles modified with elution buffer with. Kits for containing these buffers and magnetic particles are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请根据35U.S.C.§119，要求2014年12月9日提交的序列号为62/089333的美国临时申请的优先权的权益，本文以该申请为基础并将其全文通过引用结合于此。
本公开一般涉及用于核酸纯化的方法和试剂盒，更具体地，涉及用于纯化转染级别质粒DNA的基于磁性颗粒的试剂盒和方法。
技术介绍
核酸纯化(如DNA或RNA的分离)可以是多种生物化学和诊断过程中的重要步骤。质粒DNA(pDNA)可用于许多应用中，从制备载体用于克隆到产生模板用于转录或偶联转录/翻译反应。在能够进行其他加工步骤(如克隆、转染、测序、扩增、杂交和/或合成等)之前，需要从其中常发现核酸的复杂混合物(例如组织、细胞、流体等)中分离出核酸。污染物质(例如蛋白质、脂质和/或碳水化合物)的存在可能阻碍或阻止这些过程中的许多过程。例如，在分离期间携带的杂质可降低产量和/或防止酶系统合成感兴趣的产物。另外，DNA还可能污染RNA应用，反之亦然。因此，从各种不同的起始物质中有效地分离出核酸以确保所需的最终用途功能可以是重要的。在一些情况下，所选用于纯化核酸的方法影响分离的产物的多种特性，包括核酸样品的产量、质量和/或纯度。虽然已开发了许多用于核酸纯化的方法，但这些方法可能具有一种或多种缺点，包括例如成本高、复杂程度高、速度低、产量低、纯度低、污染、毒性和/或低效。先前已经用磁性颗粒在各种纯化方法中结合和分离核酸。这些方法可以具有一些优势，如消除了离心和/或真空处理步骤，得到了较高纯度的产物和/或提高了操作者的安全性。然而，使用磁性颗粒的方法仍然可能具有各种缺点，例如速度慢、复杂程度高和/或总产量低。因此，将会有利的是提供可以更快、复杂程度更低、更便宜和/或使产品纯度和/或产量提高的，用于核酸纯化的基于磁性颗粒的方法和试剂盒。所形成的经纯化的核酸可用于各种各样的生物化学和诊断应用，例如聚合酶链反应(PCR)、克隆、转染、限制性消化和临床诊断。
技术实现思路
在各个实施方式中，本公开涉及用于纯化核酸的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。根据各个实施方式，悬浮缓冲液可包含至少一种离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM。裂解缓冲液可包含至少一种去垢离液剂，其存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M。在非限定性的实施方式中，结合缓冲液可包含至少一种离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种醇，以体积计，其存在的浓度范围为约1％至约5％和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％。根据其他实施方式，第一洗涤缓冲液可包含至少一种离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；至少一种离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM和至少一种醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％。在另外的实施方式中，第二洗涤缓冲液可以包含至少一种醇和任选的至少一种盐。磁性颗粒可选自，例如，羧基包被的磁性颗粒、基于二氧化硅的磁性颗粒及其组合。本文还公开了一种核酸纯化试剂盒，其包含这些缓冲液和磁性颗粒。在以下的详述中给出了本专利技术的其他特征和优点，对本领域的技术人员而言，其中的部分特征和优点根据所作描述就可以容易地看出，或者通过实施包括以下详述、权利要求书和附图在内的本文所述的本专利技术而被认识。应理解，前面的一般性描述和以下的专利技术详述都显示了本公开的多种实施方式，并旨在提供用于理解权利要求的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的进一步的理解，附图结合于本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的各种实施方式，并与说明书一起用来解释本专利技术的原理和操作。附图简要说明结合以下附图阅读，便可以最好地理解下文中的详述，图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：图1为示出了根据本公开的一个实施方式的核酸纯化方法的流程图；图2为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的pDNA产量图；图3为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的转染效率图；图4示出了使用根据本公开的多个实施方式的方法和使用现有技术方法纯化的pDNA(使用或未使用EcoRI切割)的琼脂糖凝胶电泳分析；图5为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的pDNA产量图；和图6为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的转染效率图。详述方法本文公开了用于核酸纯化的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液，(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将所述至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。参考图1将对本公开的实施方式进行讨论，图1示出了根据本公开的非限定性实施方式的核酸纯化方法的流程图。以下总体说明旨在提供权利要求所主张方法的概述，并将参考非限定性实施方式在整个公开中对多个方面进行更具体地讨论，这些实施方式在下文所讨论的通用方法的上下文中可彼此互换。如在图1中所示，在步骤S中，包含至少一种核酸的样品(例如细菌)105可悬浮在悬浮缓冲液中。然后，在步骤L中可以裂解样品以生成裂解液，该裂解液包含pDNA120和各种污染物110，该污染物110包括不期望的核酸115(例如RNA和基因组DNA)。裂解液还可与结合/中和缓冲液结合和孵育，并且在步骤C中通过离心分离出附聚物或大分子125进行处理。接着可将磁性颗粒130加入到剩余溶液中。在步骤B中，从样品(细菌)105中释放出来的pDNA120可以可逆地结合至磁性颗粒130的表面。磁体135可用于吸引磁性颗粒130并且将它们从剩余溶液中分离出来。在步骤W中，通过使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤磁性颗粒130，可除去未结合的污染物110。接着，在步骤E中，使用洗脱缓冲液可从磁性颗粒中洗脱并分开pDNA120。在步骤P中，例如使用磁体，可从溶液中除去磁性颗粒130以生成经纯化的pDNA产物，其接着可用于各种应用。本文所用术语“包含至少一种核酸的样品”及其变化形式旨在表示从生物或环境样品中获得的任何材料(如试样或培养物)，其可以含有至少一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸纯化的方法，所述方法包括：(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液；(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液；(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含至少一种修饰的磁性颗粒，其中，所述至少一种修饰的磁性颗粒与至少一种核酸可逆结合；(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒；(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒；以及(g)将所述至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合；其中：所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，其存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种第二缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M；所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种第一盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种第一醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约1％至约5％和至少一种第三缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％；所述第一洗涤缓冲液包含至少一种第二离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；至少一种第二离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种第二醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％和至少一种第四缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；并且所述第二洗涤缓冲液包含至少一种第三醇和任选的至少一种第二盐。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.09 US 62/089,3331.一种用于核酸纯化的方法，所述方法包括：(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液；(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液；(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含至少一种修饰的磁性颗粒，其中，所述至少一种修饰的磁性颗粒与至少一种核酸可逆结合；(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒；(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒；以及(g)将所述至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合；其中：所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，其存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种第二缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M；所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种第一盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种第一醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约1％至约5％和至少一种第三缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％；所述第一洗涤缓冲液包含至少一种第二离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；至少一种第二离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种第二醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％和至少一种第四缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；并且所述第二洗涤缓冲液包含至少一种第三醇和任选的至少一种第二盐。2.如权利要求1所述的方法，其中，包含所述至少一种核酸的样品为包含质粒DNA的至少一种细菌细胞。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，并且其中，所述至少一种第一缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种去垢离液剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、月桂基硫酸铵(ALS)、十二烷基硫酸钾(PDS)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯及其组合，并且其中，所述至少一种第二缓冲化合物选自氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)及其组合。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，其中，所述至少一种第一盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合，其中，所述至少一种第一醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且其中，所述至少一种第三缓冲化合物选自冰乙酸、盐酸及其组合。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第二离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，其中，所述至少一种第二离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，其中，所述至少一种第二醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且其中，所述至少一种第四缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第三醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且其中，所述至少一种第二盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种磁性颗粒选自羧基包被的顺磁性颗粒、基于二氧化硅的顺磁性颗粒及其组合。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合之前，先离心所述溶液以除去至少一种聚集体或大分子。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括用洗脱缓冲液对至少一种修饰的磁性缓冲液孵育一个时间段，所述时间段足以使所述至少一种核酸与所述至少一种修饰的磁性颗粒分开，并且其中，所述洗脱缓冲液选自水和包含至少一种缓冲化合物和/或至少一种离子螯合剂的溶液。11.一种用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)一种悬浮缓冲液，所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；(b)一种裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，其存在的范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种第二缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M；(c)一种结合缓冲液，所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种第一盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种第一醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约1％至约5％和至少一种第三缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢宜铮，许正宜，胡军民，CL·吴，H·J·严，
申请(专利权)人：康宁股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US