基因组探针制造技术

本发明专利技术公开了标记的探针及其使用方法。标记的探针包含与对靶核酸序列包括基因组DNA序列具有特异性的gRNA缀合的Cas多肽。该探针和方法可用于标记核酸序列而无需总体DNA变性。本发明专利技术公开的主题满足部分或全部上述已确定的需求，在研究了本文中提供的信息之后，这对本领域普通技术人员而言将会是显而易见的。

Genomic probes

A labeled probe and a method of use thereof are disclosed. The labeled probes contain gRNA polypeptides conjugated to the target nucleic acid sequences, including genomic DNA sequences, which are specific to Cas. The probes and methods can be used to mark nucleic acid sequences without the overall DNA degeneration. The subject of the present invention meets part or all of the identified requirements, and will be apparent to the general technical staff in the field after studying the information provided in this article.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2014年10月17日提交的第62/065,602号美国临时申请的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
本文公开的主题涉及基因组探针。具体地，本文公开的主题涉及包含Cas多肽的探针，该CAS多肽与对靶核酸序列包括基因组DNA序列具有特异性的gRNA复合。
技术介绍
针对核酸序列的探针用于各种目的。这类探针可用于鉴定在DNA或RNA样品上能否发现特定序列，并鉴定特定序列的拷贝数。特定序列可以是与罹患某些疾病或病症的可能性相关的序列，与某些疾病或病症的阶段相关的序列，来自感染病毒、细菌和其他感染微生物的序列，编码某些基因的序列，重复序列等。这类探针可用于检测多个序列的相对位置，例如在各种癌症中频繁检测到的基因易位。因此，探测细胞的DNA可以提供可用于预测、诊断、医学和物种识别目的的有价值的信息。衍生自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的II型成簇地规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关半胱天冬酶9(Cas9)系统已经成为靶向基因组编辑的革命性工具，其核酸酶缺陷型衍生物(dCas9)也分别通过与转录调控结构域或荧光蛋白融合用于控制活细胞中基因表达和基因座的可视化。CRISPR系统提供的固有多路复用功能在高通量测定中的应用前景十分广阔。通过编程gRNA序列，Cas9蛋白可以被引导到感兴趣的任何目标DNA序列。然而，因为在一个细胞中缺乏对数十个到数百个gRNA的有效转导，因为活细胞中Cas9和gRNA的组装依赖随机碰撞，并且因为一种类型的Cas蛋白只能用一种颜色标记来成像一组靶DNA序列，所以将基因编码的Cas9蛋白和gRNA用于在活细胞中成像基因组DNA仍然受到极大限制。此外，Cas9和gRNA的基因编码表达需要将遗传物质递送至培养的活细胞，这通常不适用于原代细胞和组织。荧光原位杂交(FISH)目前用于鉴定固定细胞和组织中的特异性DNA或RNA序列。FISH通常使用甲酰胺化学和热处理来进行DNA变性。FISH包括样品变性、杂交和杂交后洗涤的步骤，这需要花费数小时至数天。(LawrenceJB,VillnaveCA,SingerRH.Cell.1988Jan15；52(1):51-61.PMID:2830981；LawrenceJB,SingerRH.NucleicAcidsRes.1985Mar11；13(5):1777-99.PMID:3889842；CremerT.LandegentJ.BruecknerA,SchollHP,SchardinM,HagerHD,DevileeP.PearsonP.vanderPloegM.(1986),\DetectionofchromosomeaberrationsinthehumaninterphasenucleusbyvisualizationofspecifictargetDNAswithradioactiveandnon-radioactiveinsituhybridizationtechniques:diagnosisoftrisomy18withprobeL.84,\Hum.Genet74:346-352；PinkelD,StraumeT.GrayJW.(1986)\Cytogeneticanalysisusingquantitative,high-sensitivity,fluorescencehybridization,\ProcNatlAcadSciUSA83:2934-2938)。尽管持续改进，DNAFISH需要诸如加热和甲酰胺的苛刻处理来使dsDNA变性以允许探针杂交，从而产生影响生物结构和基因组组织完整性的风险。在细胞中，基因组DNA在三维上被高度折叠和构造。染色质在细胞核中的空间构造和不同染色质区域的相对位置与正常发育和疾病中的基因调控密切相关。虽然使用处于其天然状态的DNA研究间期基因组构造可能是有益的，但染色质构造的研究不可能使用使天然染色体变性的FISH方法实现。DNAFISH也在检测分辨率方面受到BAC探针的限制，并且由于寡核苷酸探针的高成本而受限制。目前的FISH方案需要对样品进行变性并对所有单独的DNA探针进行荧光标记，这增加了当前FISH成像方法的复杂性和成本。DNAFISH的冗长程序也阻碍了其在研究和临床中的广泛应用。因此，仍然需要用于成像核酸序列(包括DNA)且不需要使样品变性的组合物和方法，其包括用于成像天然状态的基因组DNA的组合物和方法。还需要成像探针和可以快速操作并且不需要对样品进行长时间和苛刻处理的方法。
技术实现思路
本文公开的主题满足一些或所有上述需求，在研究了本文中提供的信息后，这对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。本
技术实现思路
描述了本文公开的主题的一些实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变化和变换。本
技术实现思路
仅仅是众多不同实施方案的示例。对给定实施方案的一个或多个代表性特征的提及同样是示例性的。这样的实施方案通常可以具有或不具有所提及的特征；同样，这些特征可以应用于本文公开的主题的其他实施方案，而无论其是否在本
技术实现思路
中列出。为了避免过度重复，此
技术实现思路
未列出或显示所有这些特征的可能的组合。本文提供了用于检测固定细胞和组织的未干扰的细胞核内的核酸序列的技术。检测目标可以是DNA、RNA和其他核酸类似物或经修饰的核酸。在一个示例性实施方案中，将来自细菌CRISPR(成簇地规律间隔的短回文重复序列)系统的蛋白质与作为探针的RNA序列组合以在完整基因组中找到目标基因。这种方法保持遗传因子的空间关系，这对于了解基因表达和检测基因易位是重要的；此外，该方法非常快速(15分钟)、方便，可直接用于组织以诊断疾病。本文公开的主题包括探针。探针包括Cas(CRISPR相关半胱天冬酶)多肽或Cas多肽的片段和/或变体，与Cas多肽缀合的、对预定核酸序列具有特异性的引导RNA(gRNA)；以及与Cas多肽、gRNA或两者结合的标记物。在一些实施方案中，所述Cas多肽与所述标记物结合或融合。在某些情况下，标记物可以是荧光蛋白、荧光标记物、染料、量子点、金颗粒、放射性标记物、化学发光酶，或修饰底物以使其通过显微镜可见的酶，或用于显微镜或其他检测方法的其他分析物。一些优选实施方案中的Cas多肽包括Cas9多肽或Cas9多肽的片段或变体。在一些实施方案中，Cas9多肽包括核酸酶缺陷型dmCas9多肽、片段和/或变体。当Cas9多肽是dmCas9多肽时，在一些实施方案中，dmCas9多肽由SEQIDNO.1的核苷酸序列编码，或者dmCas9多肽具有SEQIDNO.2序列。在一些实施方案中，Cas多肽包括CRISPRI、II、II系统中的其他CRISPR相关蛋白，如本领域普通技术人员所知晓的。在一些情况下，探针不具有核酸酶活性。在其他情况下，探针可以具有很少的核酸酶活性、降低的核酸酶活性或完全的野生型核酸酶活性。在一些实施方案中，多肽包括核定位信号(NLS)。NLS可以帮助多肽被细胞核结合。包含NLS的多肽的一个实例由SEQIDNO.3的核苷酸序列编码，或该多肽具有SEQIDNO.4序列。在一些实施方案中，所述gRNA与所述标记物结合或融合。标记物在某本文档来自技高网...

【技术保护点】
探针，其包含：Cas多肽，与所述Cas多肽复合的、对靶核酸序列具有特异性的gRNA，以及与所述Cas多肽、所述gRNA或两者结合的一个或多个标记物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.17 US 62/065,6021.探针，其包含：Cas多肽，与所述Cas多肽复合的、对靶核酸序列具有特异性的gRNA，以及与所述Cas多肽、所述gRNA或两者结合的一个或多个标记物。2.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1多肽。3.根据权利要求1或2所述的探针，其中所述Cas多肽是核酸酶缺陷的或几乎没有核酸酶活性。4.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽包括Cas9多肽。5.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽包括dmCas9多肽。6.根据权利要求5所述的探针，其中所述dmCas9多肽由包含SEQIDNO.1序列的核苷酸编码，或所述dmCas9多肽包含SEQIDNO.2序列。7.根据权利要求1或2所述的探针，其还包含核定位信号(NLS)。8.根据权利要求7所述的探针，其中所述Cas多肽由包含SEQIDNO.3序列的核苷酸编码，或所述Cas多肽包含SEQIDNO.4序列。9.根据权利要求1所述的探针，其还包含第二Cas多肽。10.根据权利要求9所述的探针，其中融合蛋白包含所述Cas多肽和所述第二Cas多肽。11.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽为Cas多肽的裂解形式。12.根据权利要求1所述的探针，其中标签与所述Cas多肽结合。13.根据权利要求12所述的探针，其中所述标签有助于所述探针的检测。14.根据权利要求12所述的探针，其中所述标签促进所述一个或多个标记物与所述Cas多肽的连接。15.根据权利要求12所述的探针，其中所述Cas多肽被表达为具有标签的融合蛋白。16.根据权利要求12-15中任一项所述的探针，其中所述标签选自HaloTag、多组氨酸标签和醛标签。17.根据权利要求12-15中任一项所述的探针，其中所述标签为HaloTag。18.根据权利要求12所述的探针，其中HaloTag和多组氨酸标签结合至所述Cas多肽。19.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽被表达为具有HaloTag和多组氨酸标签的融合蛋白。20.根据权利要求16、18和19中任一项所述的探针，其中所述多组氨酸标签为六组氨酸标签。21.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽被表达为具有HaloTag的融合蛋白。22.根据权利要求21所述的探针，其中所述一个或多个标记物经由所述HaloTag与所述Cas多肽结合。23.根据权利要求22所述的探针，其中所述gRNA不包括所述一个或多个标记物中的任何一种。24.根据权利要求1所述的探针，其中所述gRNA包含单个RNA分子。25.根据权利要求1所述的探针，其中所述gRNA包含多个RNA分子。26.根据权利要求1所述的探针，其中所述gRNA靶向所述靶核酸序列并与其杂交。27.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶核酸序列选自DNA序列、RNA序列或另一种核酸类似物的序列。28.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶核酸序列为其中一个或多个残基被修饰的核酸分子。29.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶核酸序列为未变性的天然DNA。30.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶核酸序列在尚未变性的染色体DNA内。31.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶核酸序列在含有遗传物质的样品中。32.根据权利要求31所述的探针，其中所述样品为细胞。33.根据权利要求32所述的探针，其中所述细胞为活细胞。34.根据权利要求32所述的探针，其中所述细胞为固定细胞。35.根据权利要求32所述的探针，其中所述细胞为植物细胞或动物细胞。36.根据权利要求23所述的探针，其中所述细胞为人细胞。37.根据权利要求31所述的探针，其中所述样品包含病毒、细菌或真菌。38.根据权利要求31所述的探针，其中所述样品为选自以下的生物样品：用于遗传测试的染色体涂片、培养物、产前材料、用于体外受精的样品、拭子、空气过滤器、水冷却塔、食品、饮料、头发、粪便、尿液、唾液、血液、淋巴、痰液、子宫颈涂片、精子、活检组织切片、尸体解剖组织切片及其组合。39.根据权利要求1所述的探针，其中所述Cas多肽与所述一个或多个标记物结合。40.根据权利要求1所述的探针，其中所述gRNA与所述一个或多个标记物结合。41.根据权利要求39或40所述的探针，其中所述一个或多个标记物选自荧光标记物和荧光团、染料、量子点、金颗粒、放射性标记物、磁性颗粒、酶、催化剂和分光光度标记物。42.根据权利要求39或40所述的探针，其中所述一个或多个标记物选自Alexa488、DY547、Cy5、JF549和JF646。43.根据权利要求42所述的探针，其包含多个标记物，其中每个标记物具有不同的发光颜色。44.根据权利要求1所述的探针，其中所述一个或多个标记物包含用于随后的二次标记的标签。45.根据权利要求44所述的探针，其中所述标签包含抗体靶标。46.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针与靶核酸序列结合。47.根据权利要求1所述的探针，其还包含对一个或多个其他靶核酸序列具有特异性的一个或多个其他gRNA，其中每个gRNA与所述Cas多肽复合。48.根据权利要求47所述的探针，其中多个标记物与Cas多肽、gRNA或两者结合。49.根据权利要求48所述的探针，其中多个标记物与所述Cas多肽结合。50.根据权利要求49所述的探针，其中每个标记物具有不同的发光颜色。51.根据权利要求50所述的探针，其中所述标记物选自Alexa488、DY547、Cy5、JF549和JF646。52.根据权利要求50所述的探针，其中每个标记物经由HaloTag与Cas多肽结合。53.根据权利要求51所述的探针，其中所述探针与每个gRNA的靶核酸序列结合。54.根据权利要求1所述的探针，其还包含含有一个或多个其他gRNA的一个或多个其他探针，其中每个gRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·辛格，邓伍兰，蒂莫西·莱昂尼特，
申请(专利权)人：霍华德休斯医学研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US