OsAGO18启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了OsAGO18启动子及其应用。本发明专利技术所提供的OsAGO18启动子为如下任一DNA分子：1）序列1的第795-3000位核苷酸所示的DNA分子；2）序列1所示的DNA分子；3）在严格条件下与1）或2）所限定的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；4）与1）-3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，在OsAGO18启动子启动的AGO18基因重组子转入ago18水稻突变体后能够恢复植物RSV病毒的抗性，表明该启动子在水稻体内能够受到正常的调控，而不改变水稻内源性调控体系。本发明专利技术为今后研究水稻以及其他植物的抗性提供了一个新的工具。

【技术实现步骤摘要】
OsAGO18启动子及其应用
本专利技术属于生物
，涉及OsAGO18启动子及其应用。
技术介绍
水稻作为我国主要粮食作物之一，其生产安全性直接关系到国家的经济命脉和民生问题，而植物病毒病素有“植物癌症”之称，目前未有有效的防治方法，植物一旦感染病毒将是毁灭性的，特别对于水稻植物来说将面临绝收。目前在我国水稻重要产区，水稻病毒病已经成为威胁我国粮食生产安全的重要病害之一，据全国农技中心的数据显示，水稻主要病毒病2008～2012年在全国发生面积分别为1,492.3、1,746.6、2,604、1,601.9和1,383.6万亩，防治挽回稻谷产量965,512.2、996,212.5、1,337,007、929,870.8和714,494.9吨，但仍损失大量稻谷产量。其中，由水稻条纹病毒（Ricestripevirus，RSV）引致的水稻条纹叶枯病广泛分布在江苏、云南、福建、山东等18个省市，流行严重年份甚至引起绝收，流行严重年份仅江苏省发病面积即达1962万亩（占水稻总面积79%）。水稻条纹病毒除危害水稻外，还危害小麦，导致小麦等重要粮食作物减产。这种病毒依靠灰飞虱介质传播，病毒可在虫体内复制，并且可经卵传毒，防虫治病十分困难，而且农药的使用会污染环境。而抗病育种由于抗原少、育种周期长等原因，目前很难有生产上应用广泛的高抗品种，因此筛选高效抗病品种或通过基因工程的手段获得抗病水稻品种显得尤为重要。由于对水稻病毒和寄主之间的相互作用机制缺乏系统了解，因而长期以来，尚无法设计出一些能彻底控制病毒病危害的策略。中国作为一个以水稻为主食的大国，一切不利粮食生产的安全的因素都将关系到民生的发展，因此对于水稻病毒的研究和防控是一项长期的不容忽视的工作。RNA沉默是真核生物基因表达调控的一种非常重要的策略，也是植物抵抗病毒侵染的一个方法。研究病毒和寄主之间在RNA沉默和RNA沉默的抑制对了解真核生物的基因表达调控将有重要的推动作用。该技术目前已被国际研究领域公认并应用于抗病基因工程育种以及功能基因研究。经典遗传学实验材料进行的RNA沉默实验显示了RNA沉默的几个特点:特异、高效、可扩散。与先前的正义或反义RNA技术相比，RNA沉默技术或人工构建miRNA等对同源基因表达的抑制效应至少高10倍以上。如何快速、高效地构建目标基因的反向重复序列，就成了当前利用RNA沉默机制获取对相关病毒免疫的工程植株的关键步骤。在RNA沉默过程中包含了3个核心作用元件：分别为DCLs、AGO和RDR，其在植物抗病毒防御中都发挥重要作用。其中，Argonaute（AGO）蛋白，是一个RNA结合蛋白，大小在90～130kDa，是RNA沉默过程中的核心组分可以与siRNA，miRNA或piRNA结合，形成有活性的RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）。在水稻病毒的研究中，最新的研究显示在miRNA水平上水稻矮缩病毒（Ricedwarfvirus，RDV）和水稻条纹病毒（Ricestripevirus，RSV）可能在致病机制上存在很大差异，RDV侵染水稻后对水稻miRNA影响并不明显，而RSV决然相反，它不但极大的影响了水稻miRNA的变化，而且还诱导了大量miRNA*（miRNAstar）和新的PhasedMicroRNAs的产生，并且这些miRNA*和PhasedMicroRNAs在RSV侵染条件下能够有效调控其靶基因的变化，这些新的发现则告诉我们dsRNA病毒和ssRNA病毒在致病机制上存在明显差异，并且水稻AGO蛋白可能通过调控miRNA参与了RSV的抗病毒防御防御。启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。现在已经知道，转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。本专利技术所提供的DNA分子（命名为OsAGO18启动子），具体为如下任一：（1）序列表中序列1的第795-3000位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表中序列1所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；（4）与（1）-（3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。其中，序列1由3000个核苷酸组成。含有所述DNA分子（启动子）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。在本专利技术中，所述重组载体为将pCambia1391载体的酶切位点HindIII和PstI之间的小片段替换为序列表中序列1的第795-3000位所示DNA片段的重组质粒（命名为pCambia1391-OsAGO18promoter-GUS）。具体而言，所述重组载体（pCambia1391-AGO18promoter-GUS）按照如下方法制备得到：用限制性内切酶HindIII和PstI酶切“ATAaagctt+序列1的第795-3000位+ctgcagTAT”所示DNA片段，胶回收后与经过同样双酶切回收后的pCambia1391载体的骨架大片段相连，得到所述重组载体（pCambia1391-AGO18promoter-GUS）。所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本专利技术的一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为Gus基因（来源于pCambia1391载体）；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于pCambia1391载体）。在本专利技术的另一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为序列表中序列2所示DNA分子（OsAGO18基因）或序列表中序列3所示DNA分子（OsAGO18基因前融合MYC标签序列）；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于pCambia1391载体）。所述DNA分子（启动子）在启动目的基因表达中的应用也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，所述启动目的基因在植物中表达为：当所述植物受水稻条纹叶枯病的病原菌诱导后，所述目的基因的表达量提高。所述DNA分子在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：（a）提高植物抗病性；（b）培育抗病性提高的转基因植物；（c）制备用于研究水稻基因功能的产品。在（b）所述应用中，所述培育抗病性提高的转基因植物，为：将含有所述DNA分子（启动子）的表达盒导入目的植物中，得到所述转基因植物；所述表达盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，为如下任一：（1）序列表中序列1的第795‑3000位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表中序列1所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；（4）与（1）‑（3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
2013.10.18 CN 20131049148541.DNA分子，为序列表中序列1的第795-3000位核苷酸所示的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。4.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。5.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的权利要求1所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。6.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在植物中表达的应用；所述启动目的基因在植物中表达为：当所述植物受水稻条纹叶枯病的病原菌诱导后，所述目的基因的表达量提高；所述植物为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李毅，戚益军，吴建国，杨志蕊，郑立佳，魏春红，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11