光活性荧光团和体内标记方法技术

本发明专利技术提供了光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体。光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia‑Fluor染料的可光活化衍生物。光活性配体包括光活性荧光团和蛋白标签。光活性复合体包括与蛋白缀合的光活性配体。本发明专利技术还提供了用光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体进行体内标记和光活化光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光活性荧光团和体内标记方法相关申请本申请要求2016年5月20日提交的第62/339,643号美国临时专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
本专利技术的主题一般性地涉及光活性荧光团和体内标记方法。更具体地，本专利技术的主题涉及小分子光活性荧光团，用小分子光活性荧光团在体内标记的方法，以及荧光化合物的体内光活化方法。
技术介绍
小分子荧光团是用于高级成像实验的重要工具。这些比荧光蛋白更亮的荧光团，是现代显微镜检查的关键要素。最近，新的蛋白特异性标记策略的开发，例如Johnsson倡导的自我标记标签概念，已经能够在活细胞内形成荧光生物缀合物：可透过膜的合成染料“配体”被动地扩散到细胞中，在细胞中与它们的同源蛋白“标签”形成共价键。这种类型的自我标记标签将遗传编码(荧光蛋白的主要优点之一)与有机荧光团的有利光物理学结合在一起。基于这些复杂的连接技术，本专利技术人最近报道了掺入四元氮杂环丁烷环可以显著改善小的、可渗透细胞的荧光团的亮度和光稳定性。这些“JaneliaFluor”(JF)染料是用于活细胞成像的优秀标记，特别是在单分子跟踪实验中，它们可以实现更长时间的观察和更好的单个荧光缀合物的定位。然而，大多数笼子基团(caginggroup)大且疏水，这降低了溶解度和与自我标记标签蛋白的反应性。此外，经典的光笼策略与诸如JF549和JF646的完全N-烷基化罗丹明染料不相容。尽管Hell及其同事已经发现了一种笼化策略，其中用草酰氯和重氮甲烷处理罗丹明染料产生无色且无荧光的螺环重氮酮，但该策略尚未应用于具有环胺取代基的染料。此外，尽管所得的重氮酮笼化染料已被用作固定细胞成像的抗体标记，但它们尚未被加入至自我标记标签系统中，也未用于活细胞中。因此，仍然需要可光活化(PA)形式的JF染料，其与现有的活细胞标记策略相容并保持JF染料的优异亮度。
技术实现思路
本专利技术的主题满足上述需求中的一些或全部，这对于研究本文提供的信息之后的本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本
技术实现思路
描述了本专利技术主题的若干实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变型和置换。本
技术实现思路
仅仅是众多不同实施方案的示例。对给定实施方案的一个或多个代表性特征的提及同样是示例性的。这样的实施方案通常可以存在或不存在所提及的特征；同样地，无论是否在本
技术实现思路
中列出，这些特征可以应用于本专利技术主题的其他实施方案。为避免过度重复，本
技术实现思路
未列出或建议这些特征的所有可能组合。在一些实施方案中，本专利技术的主题涉及光活性荧光团。在一些实施方案中，光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。在一些实施方案中，光活性荧光团通过光诱导脱羧。在一些实施方案中，本专利技术的主题涉及形成光活性荧光团的方法。在一些实施方案中，该方法包括笼化Janelia-Fluor染料。在一些实施方案中，笼化Janelia-Fluor染料包括将草酰氯加入到Janelia-Fluor染料的溶液中以形成第一混合物，将三乙胺和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷依次加入至第一混合物中以形成第二混合物，浓缩第二混合物以形成浓缩物，并纯化浓缩物以证明光活性荧光团。在一些实施方案中，笼化的Janelia-Fluor染料包括Si-罗丹明。在一些实施方案中，本专利技术的主题涉及包含光活性荧光团和蛋白标签的光活性配体。在一些实施方案中，光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。合适的蛋白标签包括但不限于HaloTag配体、SNAP-tag配体、任何其他合适的蛋白标签或它们的组合。在一些实施方案中，光活性配体与同源蛋白的缀合增加光解后光活性配体的光吸收。在一些实施方案中，光活性荧光团的亮度基本上类似于衍生光活性荧光团的亲本荧光团的亮度。在一些实施方案中，本专利技术的主题涉及光活性复合体，其包含与蛋白缀合的光活性配体。在一些实施方案中，光活性配体在体内与蛋白缀合。在一些实施方案中，光活性配体包含光活性荧光团和蛋白标签。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置为在光诱导时脱羧。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时形成甲基-Janelia-Fluor化合物。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时提供增加的荧光。附图说明在所附权利要求中具体阐述了本专利技术的新的特征。通过参考以下阐述使用本专利技术原理的说明性实施方案的详细描述以及附图将获得对本专利技术的特征和优点的更好理解，其中：图1A-I示出说明可光活化的JaneliaFluor549(PA-JF549)的合成、表征和效用的图表和图像。(A)PA-JF549的合成和光化学过程。用草酰氯和TMS重氮甲烷处理JF549(1)得到PA-JF549(2)。光活化(365nm)仅产生痕量的预期的苯乙酸衍生物(3)，其中甲基取代的JF549(4)为主要产物(50％)，而inadone5为次要产物(10％)。(B)1、3和4的归一化吸收(abs)和荧光发射(fl)。(C)PA-JF549-HaloTag配体(6)和PA-JF549-SNAP-tag配体(7)的化学结构。(D)用PA-JF549配体6标记的HaloTag-Sox2的累积单粒子轨迹的图像，比例尺：5μm。(E)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝120.7光子)或mEos3.2融合(黑色，中值＝70.9光子)进行Sox2的sptPALM时检测到的光子/粒子/帧的直方图。(F)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，平均值＝0.20s)或mEos3.2融合(黑色，平均值＝0.07s)进行Sox2的sptPALM时的轨迹长度的直方图。(G)表达TOMM20-HaloTag并用PA-JF549配体6标记的U2OS细胞的PALM图像；根据它们在半最大值处的全宽定位显示268,561个检测到的分子；比例尺：2μm。(H)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝636.6光子)或mEos3.2融合(黑色，中值＝266.8光子)进行TOMM20的PALM时检测到的光子/定位/帧的直方图。(I)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝13.5nm)或mEos3.2融合(黑色，中值＝20.2nm)进行TOMM20的PALM时计算的定位精度的直方图。图2A-H示出使用可光活化的JaneliaFluor646(PA-JF646)的多色成像的图表和图像。(A)PA-JF646-HaloTag配体(16)和PA-JF646-SNAP-tag配体(17)的结构。(B)表达TOMM20-HaloTag并用10nMJF549-HaloTag配体8和10nMPA-JF646-HaloTag配体16标记的U2OS细胞的图像。来自JF549-HaloTag配体8的宽场荧光显微镜图像的空间分布类似细胞中典型的线粒体分布(比例尺：5μm)。将用PA-JF646标记的单个TOMM20融合体的轨迹(n＝154)绘制在平均宽场TOMM20-JF549信号上(插图；比例尺：1μm)。大多数单分子轨迹(>95％)与JF549-HaloTag信号共定位，表明PA-JF646的特异性标记。(C-G)在表达用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光活性荧光团，其包括含氮杂环丁烷的Janelia‑Fluor染料的可光活化衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.20 US 62/339,6431.一种光活性荧光团，其包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。2.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述荧光团通过光诱导脱羧。3.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述可光活化衍生物为可光活化的Janelia-Fluor549。4.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述可光活化衍生物为可光活化的Janelia-Fluor646。5.一种形成光活性荧光团的方法，所述方法包括笼化Janelia-Fluor染料。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述笼化包括：将草酰氯加入到Janelia-Fluor染料的溶液中，形成第一混合物；将三乙胺和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷依次加入至所述第一混合物中，形成第二混合物；浓缩所述第二混合物，形成浓缩物；纯化所述浓缩物，以提供所述光活性荧光团。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Janelia-Fluor染料包含Si-罗丹明。8.一种光活性配体，其包括光活性荧光团和蛋白标签。9.根据权利要求8所述的光活性配体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢克·D·拉维斯，乔纳森·B·格林，
申请(专利权)人：霍华德休斯医学研究所，
类型：发明
国别省市：美国,US