利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法技术

本发明专利技术涉及用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法。本发明专利技术在于除了现有技术中公知的基于双光子激发的测定方法的基本步骤之外，该方法还包括其它步骤：a)记录设备的多个微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；b)采用记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算设备的校正矩阵，和c)采用校正矩阵校正来自所述设备的微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵采用记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射计数对于设备获得。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法专利技术的
本专利技术涉及体外诊断测定和双光子激发的荧光作为测量生物亲和性测定的检测原理的用途。专利技术背景本文用于说明本专利技术的背景的出版物和其它材料，和特别是提供关于实践的其它细节的实例通过引用并入。荧光在生物亲和性测定中的应用已经在生物分析领域中发现单光子激发荧光的各种应用。在过去的几十年期间，已经引入使用荧光作为检测方法的应用，例如免疫测定、DNA杂交测定和受体结合测定。这些测定利用特异性生物亲和性反应来测定样品中的分析物。可以通过监测取决于结合分析物的量的荧光信号来确定分析物的量。这些测定还可以基于监测特定结合反应时荧光性质的变化。荧光性质的这种变化可以是荧光强度的变化、发射波长的变化、衰减时间的变化或荧光偏振的变化。免疫测定已广泛用于体外诊断以确定某些疾病或生理状况。免疫测定可分为两种不同类型的测定，竞争性和非竞争性测定。在竞争性方法中，标记抗原(第二生物特异性试剂)与分析物竞争结合到有限量的抗体(第一生物特异性试剂)。分析物的浓度可以由结合到抗体的标记抗原的比例或由标记抗原的游离部分的比例确定。在非竞争性方法(免疫测定方法)中，分析物结合到过量的结合抗体(第一生物特异性试剂)。过量的标记抗体(第二生物特异性试剂)结合到分析物的另一个位点。可以基于结合到分析物的标记抗体的部分来确定分析物的量。除非检测原理能够将结合部分的信号与游离部分的信号区分开，否则在检测之前通常需要物理分离结合和游离部分。因此，测定方法分为分离测定和无分离测定，通常也称为非均相和均相测定。[MiyaiK.,PrinciplesandPracticeofImmunoassay,(PriceC.P.和NewmanD.J.编辑)StocktonPress,NewYork1991,246和HemmiläI.A.,ApplicationsofFluorescenceinImmunoassays,(WinefordnerJ.D.编辑)JohnWiley&Sons,NewYork1991]。双光子激发的荧光当通过聚焦强光源，每单位体积和每单位时间的光子密度变得足够高以使两个光子被相同发色团同时吸收时，产生双光子激发。吸收的能量是两个光子的能量之和。双光子激发的概率取决于光子密度的二次方。因此，两个光子的吸收是二阶非线性过程。通过一个发色团同时吸收两个光子产生处于激发态的发色团。然后通过自发发射具有比照明光子更高能量的光子使该激发态弛豫。在这种情况下，包括双光子激发和随后的辐射弛豫的过程称为双光子激发的荧光。TPE通常具有与相同发色团的单光子激发荧光的发射性质类似的发射性质[XuC.和WebbW.W.,J.Opt.Soc.Am.B,13(1996)481]。双光子激发的关键特点之一是激发仅发生在焦点的明显受限的三维(3D)附近。该特点的结果是产生的荧光发射的高3D空间浓度。由于激发的非线性特性，在焦点体积外，即在周围的样品介质中和在光学部件中产生最小的背景荧光。双光子激发的另一个关键特点是照明和发射在基本上不同的波长范围内发生。该性质的结果是通过使用低通滤波器(衰减至少10个数量级)，可以容易地衰减荧光发射的检测通道中的散射照明光的泄漏。由于激发体积非常小(在飞升的范围内，即10-15升)，双光子激发最适合于观察小的样品体积和结构。如果用箔(或其它类型的盖子)覆盖比色皿且用薄的分配针通过箔进行样品分配，则与打开的比色皿相比，溢出的概率将降低。在这种情况下，溢出的概率将与穿刺针的直径成比例。然而，即使在这种情况下，在震动期间很可能发生溢出且在孵育期间可能发生显著蒸发。这些会损害测定性能。利用双光子激发的荧光的生物分析应用关于双光子激发的分析应用的早期报道之一由Sepaniak等人[Anal.Chem.49(1977),1554]发表。他们讨论使用双光子荧光激发进行HPLC检测的可能性。证明系统的低背景和简单性。Lakowicz等人[J.Biomolec.Screening4(1999)355]报道在高通量筛选应用中使用多光子激发。他们已经表明在高密度多孔板中可以可靠地测量双光子诱导的荧光素荧光。文献中描述的双光子激发的荧光的大多数生物分析应用涉及双光子成像显微术[DenkW.等人,US5,034,613,DenkW.等人,Science248(1990)73]。在激光扫描显微术中使用双光子荧光激发提供固有的3D空间分辨率，而没有使用针孔，这是共聚焦显微术所必须的。用简单的光学设计，双光子激发显微术提供与普通单光子激发共聚焦显微术的3D空间分辨率相当的3D空间分辨率。该发展还导致双光子激光扫描显微镜系统的工业制造。双光子激发技术的缺点是需要昂贵的激光器，其能够产生具有高重复频率的强烈超短脉冲。较便宜的激光技术的发展使得能够在常规生物分析应用中使用双光子荧光激发技术[HänninenP.等人,Nat.Biotechnol.18(2000)548；SoiniJ.T.等人SingleMol.1(2000)203；SoiniJT(2002)Crit.Rev.Sci.Instr.,WO98/25143,WO99/63344和WO05/078438]。根据WO98/25143、WO99/63344和WO05/078438，替代昂贵的锁模激光器，被动调Q二极管泵浦微芯片激光器可用于双光子激发。这些激光器是单片、小型、简单且低成本。WO98/25143和WO99/63344描述双光子激发的荧光在检测生物亲和性测定中的用途。该生物亲和性测定技术采用微粒作为第一生物特异性试剂所结合的生物亲和性结合固相。该生物亲和性测定技术利用用双光子荧光染料标记的生物特异性第二试剂。根据WO98/25143和WO99/63344中描述的方法，在微粒表面上形成生物亲和性复合物，并通过测量来自单个微粒的双光子激发的荧光来量化生物亲和性复合物的量。因此，该测定技术使得能够在微量体积中实现无分离的生物亲和性测定。标记的第二生物亲和性试剂通过分析物分子结合在微粒表面上以形成三组分生物亲和性复合物(非竞争性、免疫测定方法)或其直接结合到第一生物特异性试剂以形成双组分生物亲和性复合物(竞争性结合方法)。第一和第二生物特异性试剂是生物活性分子，例如半抗原、生物活性配体、药物、肽、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段、核苷酸、寡核苷酸或核酸。根据WO98/25143和WO99/63344，将具有高双光子激发效率的激光聚焦到反应悬浮液中，且当单个微粒漂浮通过激光束的焦点体积时，从单个微粒测量双光子激发的荧光。或者，可以用光阱捕获微粒以进行一段时间的荧光检测，该光阱由激光束引起。微粒捕获到激光束的焦点是基于由照明激光在微粒上产生的光学压力。通过二维压电驱动的扫描仪从反应悬浮液主动搜索微粒。当在焦点体积附近发现微粒时，扫描仪能够暂时停止扫描动作。来自单个微粒的荧光信号通过光电倍增管检测。专利技术目的和概述本专利技术的目的是提供一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液样品中的分析物的改进的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含对所述分析物生物特异性的第一试剂所结合的微粒的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物生物特异性的第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：a) 使包含对所述分析物(4)生物特异性的第一试剂(2)所结合的微粒(1)的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物(4)生物特异性的第二试剂(3)在反应体积中同时接触，从而引发反应，b) 使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒(1)的聚焦激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，c) 当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒(1)时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，d) 对所述微粒(1)施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和e) 检测来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数；其特征在于，所述方法还包括：f) 记录设备的多个所述微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；g) 通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和h) 通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.25 FI 201651481.一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含对所述分析物(4)生物特异性的第一试剂(2)所结合的微粒(1)的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物(4)生物特异性的第二试剂(3)在反应体积中同时接触，从而引发反应，b)使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒(1)的聚焦激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，c)当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒(1)时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，d)对所述微粒(1)施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和e)检测来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数；其特征在于，所述方法还包括：f)记录设备的多个所述微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；g)通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和h)通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。2.权利要求1的方法，其特征在于，通过采用在所定义的在先时间段内记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数，连续地或以预设的间隔或时间点重新计算校正矩阵。3.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：N普尔祖，J索卡，
申请(专利权)人：爱可达国际有限公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI