一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法技术

本发明专利技术公开了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。通过选择合适的激活光和激发光的波长范围，同时控制合适的激活方向和样品上表面的夹角，实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品表层荧光的精确控制，激活方便，激活表层厚度薄；本发明专利技术的荧光控制方法激活时只激活生物组织包埋样品表层的荧光，应用于生物组织包埋样品的荧光层析成像时，激发光激发被激活表层而进行荧光成像，样品被激活表层的厚度即为荧光成像的轴向分辨率，轴向分辨率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光显微成像领域，具体地，涉及一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法。
技术介绍
某些荧光蛋白的光物理性质能够被光精确控制，这类荧光蛋白叫光控荧光蛋白。它至少包括如下两类，光激活荧光蛋白和光转换荧光蛋白。光激活荧光蛋白在初始状态时不发荧光，经过特定波长激活光激活后，能够被激发出荧光，比如PAGFP。光转换荧光蛋白在初始状态时就可以发荧光，但是经过激活光激活后，可以被激发出另外一种颜色的荧光，比如mEos3.1、mEos3.2等。光控荧光蛋白标记的生物组织和普通荧光蛋白标记的生物组织，成像方法类似，常用普通的宽场成像方法或者用共聚焦、双光子点扫描成像。对于大的生物组织，常常需要包埋剂包埋后进行断层成像。由于缺乏合适的荧光控制方法，导致现有技术采用光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品在成像时有一个巨大的缺陷：快速的宽场成像方法层析能力差，无法实现高分辨；而高分辨的点扫描成像方法，如共聚焦或双光子成像，对于体积大的生物组织包埋样品则成像太慢。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，其目的在于通过对光敏感的光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品使用特定波长的激活光激活样品表层光控荧光蛋白，再通过相应波长的激发光激发样品表层的荧光蛋白，实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的表层荧光的控制，且通过优化荧光控制条件来使其表层激活厚度更薄，并将之应用于荧光层析成像，表层被激活的厚度即为层析成像时的轴向分辨率，由此解决现有技术的荧光蛋白标记生物组织由于缺乏有效的荧光控制方法而在快速宽场荧光成像时由于层析能力差、轴向分辨率低，而高分辨的点扫描成像方法对于体积大的生物组织包埋样品成像太慢的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。优选地，所述光控荧光蛋白为光激活荧光蛋白或光转换荧光蛋白。优选地，所述表层的厚度为0.5～5微米。优选地，所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。优选地，所述激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光。优选地，所述激活光的方向和样品上表面的夹角为0～90°。优选地，所述激活光的方向和样品上表面的夹角为15°～30°。优选地，所述生物组织包埋样品的包埋剂优选为树脂。优选地，所述树脂为丙烯酸树脂。优选地，所述包埋剂中添加有吸收光的物质。优选地，所述吸收光的物质为苏丹黑。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。(1)本专利技术提供的光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，通过选择合适的激活光和激发光的波长范围，同时控制合适的激活方向和样品上表面的夹角，实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品表层荧光的精准控制，激活方便，控制效果好；(2)本专利技术的荧光控制方法激活时只激活生物组织包埋样品表层的荧光，应用于生物组织包埋样品的荧光层析成像时，激发光激发被激活表层而进行荧光成像，样品被激活表层的厚度即为荧光成像的轴向分辨率，通过优化荧光控制条件，包括优选激活光的波长、控制激活光与样品的夹角以及采用包埋剂中添加吸收光的物质来控制被激活表层的厚度，厚度可以低至1～2微米甚至更低，有望实现高分辨层析成像；(3)在用激活光激活光控荧光蛋白时，只激活包埋样品的表层，而表层以下没有被激活光激活，因此表层以下组织即使吸收了后续的激发光也无法发出荧光，从而避免了后续宽场成像时组织表层以下非焦面荧光的干扰；(4)本专利技术的荧光控制方法应用于生物组织包埋样品的荧光成像时，由于不存在焦面以下荧光的干扰，因此可以用于高通量面成像，即快速宽场成像，另外由于表层激活厚度即轴向分辨率可以达到1～2微米，甚至更薄，因此本专利技术的荧光控制方法应用于荧光层析成像时，同时具备了宽场成像的高速度以及与点扫描成像近似的高分辨，实现了大体积生物组织包埋样本的快速高分辨成像。附图说明图1是光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品荧光控制并成像的示意图，其中①表示激活光，②表示激发光，③表示样品，④表示激发和成像物镜，⑤表示已激活样品表层；图2是实施例1所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图；图2(A)为实施例1激活前激发的荧光强度；图2(B)为实施例1激活后激发的荧光强度，其中激活光波长为405nm；图3是实施例2所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图；图3(A)为实施例2激活前激发的荧光强度；图3(B)为实施例2激活后激发的荧光强度。在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中图2的比例尺代表20微米。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本专利技术提供的光控荧光蛋白标记生物组织的荧光控制方法，并应用于生物组织包埋样品的层析成像时，包括以下步骤：一、样本包埋将光控荧光蛋白标记的生物组织用包埋剂包埋，包埋的具体过程参照包埋剂商品说明书或者公开文献资料的一般步骤。所述生物组织包埋样品的包埋剂优选为树脂，所述树脂优选为丙烯酸树脂，包括HM20(lowicryls丙烯酸盐类树脂)、HM23(lowicryls丙烯酸盐类树脂)、T9100、伦敦白胶(LRwhite)等。二、不同方向激活激发图1是光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品荧光控制并成像的示意图，其中①表示激活光，②表示激发光，③表示样品，④表示激发和成像物镜，⑤表示已激活样品表层。将所述生物组织包埋样品在非成像光路上用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白的荧光，然后在成像光路上用对应波长的激发光激发该荧光蛋白的荧光并成像。所述成像光路指接收发射光谱(即荧光信号)的光路，所述非成像光路指成像光路之外的其他光路。所述“激活”是指，光控荧光蛋白在特定波长激发光的激发下，几乎不发某个波段的荧光，只有经过另外某个波长的“激活光”激活后，开启了荧光蛋白，使之接受特定波长“激发光”激发从而发出荧光。而“激发”是指荧光蛋白吸收某个波长的光发出荧光的过程。标记生物组织的光控荧光蛋白包括光激活荧光蛋白(PhotoactivatableFPs，PAFPs)中的一种或多种，如PAGFP、PAmCherry1等；或者光转换荧光蛋白(photoswitchableFPs，rsFPs)中的一种或多种，如Dendra2、mEos3.1等。所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。所述激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光。所述的激活光的方向和所述样品上表面的夹角为0～90°，优选为15～30°。通过调节激活光与样品上表面(即成像层或已激活样品表层)的夹角，可以控制合适的激活厚度。激活光与样品上表面的夹角可以在0度到90度范围内，15°～30°有利于激活更薄厚度的表层。当激活光与样品上表面的夹角为0°时，激活光平行于样品上表层，此时需要对样品进行透明化处理，采用类似光片照明的方法从侧面激本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，其特征在于，用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。

【技术特征摘要】
1.一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法，其特征在于，用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。2.如权利要求1所述的荧光控制方法，其特征在于，所述光控荧光蛋白为光激活荧光蛋白或光转换荧光蛋白。3.如权利要求1所述荧光控制方法，其特征在于，所述表层的厚度为0.5～5微米。4.如权利要求1所述的荧光控制方法，其特征在于，所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。5.如权利要求1所述的荧光控制方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓华，刘秀丽，张其，郭文炎，杨雄，曾绍群，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42