一种别藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种别藻蓝蛋白（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）标记的荧光抗抗体的制备方法。制备过程包括：阴离子交换层析法分离纯化螺旋藻ＡＰＣ，用化学交联剂ＳＰＤＰ分别将ＡＰＣ、抗抗体衍生，两种衍生物再以适宜摩尔比液相交联，经高压液相色谱纯化制备出ＡＰＣ标记的荧光抗抗体。本发明专利技术制备的荧光抗抗体交联效率高、纯度高、红色荧光明亮、稳定性好、灵敏度高，可作为通用荧光探针用于鸡、猪等动物传染病的间接免疫荧光检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的荧光抗抗体的制备 方法，属于免疫荧光检测领域。
技术介绍
免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析法，兼具抗原、抗体反应的特异性及 荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测和生物学研究中。免疫荧光检测法的特异性和敏 感性依赖于荧光染料、抗体及荧光探针的属性和质量。实际应用时，由于血清和其他生物样 品发射波长为400-600nm的本底荧光，与常用的FITC等传统荧光染料的荧光发射光谱重 叠，严重降低荧光检测的灵敏度，造成一段时期内荧光检测法发展缓慢。藻胆蛋白是存在于红藻和蓝藻细胞中的一类水溶性的色素蛋白的总称，是藻类捕 光天线复合物的重要组成部分，能够高效捕获并传递光能。藻胆蛋白分为藻红蛋白(PE)、 藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蓝蛋白(PEC)四大类，具有水溶性大、无毒性、稳 定性好、荧光量子产率高、斯托克位移大、荧光明亮、荧光不易淬灭等优点，是优秀的荧光染 料。藻胆蛋白应用于荧光检测，极大地提高了荧光检测的灵敏度，促使多色荧光检测和能量 共振转移(FRET)荧光探针检测成为现实。别藻蓝蛋白(APC)的稳定态为(α β )3，分子量约为IlOkDa, Amax = 620_650nm， Em = 660nm，摩尔消光系数为7 X IO5CnT1M-1,荧光量子产率为68%。APC是藻胆蛋白中发射 荧光波长最大的一类，能够发射明亮的红色荧光，极易与生物质本底的蓝色或绿色荧光区 分，因此APC几乎不受生物质本底荧光影响，荧光检测灵敏度明显提高，APC的检测灵敏度 是cy5的7倍。APC是少有的长波长发射的荧光染料，红光激发红光发射，促进了 633nm氦 氖激光器的应用。APC是优秀的发射红色荧光的染料，但由于APC分离纯化困难、稳定性差，蛋白质 交联时难以定量控制，造成APC标记得率低，生产成本高，甚至造成APC失活、荧光丧失，限 制了这一优秀染料在临床检测中的应用。国内外尚没有APC标记荧光抗体应用于动物疫病 检测的报道。本专利技术采用适宜摩尔比的化学交联剂SPDP分别将APC、抗抗体衍生，然后定量 交联高效制备了 APC标记的荧光抗抗体，可作为通用荧光探针用于鸡或猪传染病的间接免 疫荧光检测。
技术实现思路
本专利技术涉及一种别藻蓝蛋白(APC)标记的荧光抗抗体的制备方法。本专利技术采用的螺旋藻别藻蓝蛋白(APC)是优秀的荧光染料，具有无毒性、水溶性 大、荧光明亮且不易淬灭等特点，检测灵敏度显著高于传统的FITC等荧光染料。APC在荧光 染料中独树一帜，在波长550-650nm的光激发下，APC能发射明亮的红色荧光，是少有的发 射长波长荧光染料，而且APC等红色荧光染料的发现促进了 633nm氦氖激光器在荧光检测 中大量应用。3APC的组成和晶体结构特点决定了其稳定性低于其它藻胆蛋白，因此交联时控制 使用交联剂的浓度是关键，交联剂浓度不仅影响交联得率还影响荧光特性。本专利技术选择 SPDP与APC和抗抗体的摩尔比分别为20-50 U50-100 1，衍生后的APC与抗体以摩 尔比1-2 1交联，制备的APC标记的荧光抗抗体交联效率高、纯度高、荧光明亮、抗体活性 好、稳定性好。本专利技术的解决方案如下别藻蓝蛋白(APC)的制备APC为采用阴离子交换层析法由钝顶螺旋藻 (Spirulina platensis)中分离纯化。纯化步骤为藻体细胞加入5倍体积(v/w)的2OmM 磷酸缓冲液(PH6. 8-7. 0)，反复冻融3次，4°C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓 度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心，沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，用20mM 的磷酸缓冲液(PH7)透析，透析液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱层析， 离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液 (pH3. 6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋 白。纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓 度为 5-10mg/mLoAPC标记荧光抗抗体的制备抗抗体(抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体)购自Sigma 公司，电泳检测纯度达电泳纯，对流免疫电泳法检测抗抗体具有良好的生物学活性，使用时 用PBS透析，调整蛋白浓度为5-10mg/ml。APC与抗抗体的交联采用蛋白质交联法技术，利 用异型双功能交联剂SPDP分别在APC、抗抗体上衍生吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗抗体 的衍生物为其引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的APC衍生物与携带巯基的抗抗体按一定 摩尔比交联制备荧光抗抗体。SPDP与APC、抗抗体的摩尔比分别为20-50 1,50-100 1， DTT与衍生抗体的摩尔比为50-100 1，SPDP衍生的APC与带-HS的抗抗体再以摩尔比 1-2 1液相交联制备APC标记的荧光抗抗体。APC标记的荧光抗抗体的高效纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC 法进行荧光抗抗体的纯化和交联效率分析，流动相为50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, 检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号为TSK G3000sw (规格 7. 5mmX60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来(附图1)。收集洗脱峰，进行光谱学、抗体 活性、电泳检测。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰面积的比例即为交联得率。APC标记荧光抗抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定， 扫描波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致APC 变性。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580·，荧光扫描范围为 600-700nmo APC标记荧光抗抗体在紫外区的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位置相同，这 是因为APC表面交联了 280nm有较强的光吸收的抗抗体分子，而在450-700nm区间，交联物 的吸收光谱与APC的吸收峰及吸光度相似，这是因为抗抗体在此范围内无光吸收。APC标记 光抗抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生 斯托克位移改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低(附图2)。APC标记荧光抗抗体的效价检测对流免疫电泳法检测APC标记荧光抗抗体的免 疫学活性。APC标记荧光抗抗体与鸡IgG形成天蓝色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察 到沉淀线的位置(附图3)。天蓝色免疫沉淀线的形成进一步说明抗抗体与APC交联成功，同时也说明交联反应对抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物仍保留较高的抗体活性。APC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%，218V恒压电泳。用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250 染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现APC标记荧光抗抗体既具有APC的α、β亚基 条带，又具有抗体的H、L链条带(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种别藻蓝蛋白（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）标记的荧光抗抗体的制备方法，包括：阴离子交换层析法分离纯化螺旋藻ＡＰＣ，分别用摩尔比为２０－５０∶１、５０－１００∶１的化学交联剂ＳＰＤＰ将ＡＰＣ、抗抗体衍生，抗抗体的ＳＰＤＰ衍生物经摩尔比５０－１００∶１的ＤＴＴ还原获得带－ＨＳ的抗抗体，带－ＨＳ的抗抗体与ＡＰＣ的ＳＰＤＰ衍生物以摩尔比１∶１－２液相交联，经ＨＰＬＣ纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的快速免疫荧光检测。

【技术特征摘要】
一种别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记的荧光抗抗体的制备方法，包括阴离子交换层析法分离纯化螺旋藻APC，分别用摩尔比为20 50∶1、50 100∶1的化学交联剂SPDP将APC、抗抗体衍生，抗抗体的SPDP衍生物经摩尔比50 100∶1的DTT还原获得带 HS的抗抗体，带 HS的抗抗体与APC的SPDP衍生物以摩尔比1∶1 2液相交联，经HPLC纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的快速免疫荧光检测。2.根据权利要求1的方法，其中APC由钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分离纯 化，制备过称为藻体细胞加入5倍体积(v/w) 20mM磷酸缓冲液(pH6. 8 7. 0)，反复冻融 3次，4°C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离 心，沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含 50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/ h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白，纯化的螺旋藻APC纯度达电泳纯，纯度 指数A650A280 >5，结构式为(α β)3，分子量约为IlOkDa,最大吸收峰位于650nm，在620...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽萍，颜世敢，姚强，吕爱杰，赵守山，
申请(专利权)人：颜世敢，
类型：发明
国别省市：88[]