一种Ｒ－藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种Ｒ－藻蓝蛋白（Ｒ－ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＲＰＣ）标记的荧光抗抗体的制备方法。制备过程为：阴离子交换层析法制备ＲＰＣ，分别用摩尔比２０－３０∶１、５０－１００∶１的双功能化学交联剂ＳＰＤＰ将ＲＰＣ、抗抗体衍生，衍生物以适宜摩尔比液相交联，经高压液相色谱纯化制备出ＲＰＣ标记的荧光抗抗体。本法制备的ＲＰＣ标记的荧光抗抗体交联效率高，纯度达电泳纯，红色荧光明亮，荧光抗体活性稳定，可作为通用荧光探针用于动物传染病的间接免疫荧光检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin，RPC)标记的荧光抗抗体的制备方 法，属于免疫荧光检测领域。
技术介绍
免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析法，兼具有抗原、抗体反应的特异性 及荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测和生物学研究中。免疫荧光检测法的特异性和 敏感性依赖于荧光染料、抗体及荧光探针的属性和质量。在实际应用时，由于血清和其他生 物样品发射波长为400 600nm的本底荧光，与常用的FITC等传统荧光染料的荧光发射光 谱重叠，严重降低荧光检测的灵敏度，造成一段时期内免疫荧光检测法发展缓慢。多管藻是生长在我国沿海地区潮间带的特有海洋红藻，含有大量的R-藻蓝蛋 白，是提取R-藻蓝蛋白的比较理想的试材。R-藻蓝蛋白的稳定态为(α β)3，分子量约为 104. 9kDa,是唯一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白。多管藻RPC有2个吸收峰，最大吸收峰 分别位于540、620nm。540nm激发光激发时室温最大荧光发射峰位于632nm。与传统的荧光 染料相比，RPC具有水溶性、无毒性、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、发射 红色荧光、背景光干扰小、不易淬灭等特点，因而是一类优秀的荧光染料。RPC用于免疫荧光检测需要将其与抗体或抗抗体交联制备荧光探针，RPC与抗体 交联得率低，造成RPC荧光标记物生产成本居高不下，成为限制其应用的瓶颈因素。本专利技术 选择温和型的异型双功能化学交联剂SPDP将RPC与抗抗体液相化学交联制备通用型荧光 抗抗体，通过优化交联剂浓度既保证了交联效率又不影响荧光亮度和抗体活性，成功制备 出RPC标记的荧光二抗，可方便地用于传染病病原的间接免疫荧光检测，省去了直接免疫 荧光检测时需要针对每种病原的抗体制备荧光标记抗体的麻烦，同时采用标记的抗抗体作 为信号放大系统，还能提高免疫荧光检测的灵敏度。目前国内外尚没有RPC应用到动物疫 病检测中的报道。
技术实现思路
本专利技术涉及一种R-藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法。本专利技术采用的R-藻蓝蛋白(RPC)是纯化自多管藻的典型的二峰型藻蓝蛋白，是唯 一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白，具有无毒性、水溶性大、荧光明亮且不易淬灭等特点。 RPC的组成和晶体结构特点决定了低稳定性，因此在蛋白质交联是控制交联剂的浓度是关 键，浓度过高会造成RPC的变性和荧光丧失，浓度过低则交联效率降低。本专利技术的解决方案如下RPC的制备RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，纯化过程 为取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)，4°C下溶胀24h，多层纱布过滤、 挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60% (w/v)，4°C放置24h，离心收集 沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用 20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的R-藻蓝蛋白，用20mM醋酸缓冲液 (pH4. 8)(含50mMNaCl) —步洗脱就可得到大量纯的R-藻蓝蛋白，纯化的多管藻RPC纯度达 电泳纯，纯度指数A62tZA28tl >4. 5，结构式为(α β)3，分子量约为llOkDa，最大吸收峰分别 位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前 用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。RPC标记荧光抗抗体的制备抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公 司，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。RPC与抗抗体的交联采用蛋白质交联法。 利用异型双功能交联剂SPDP分别在RPC、抗抗体上衍生吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗 抗体的衍生物引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的RPC与携带巯基的抗抗体按一定摩尔比 交联制备荧光抗抗体。以DMSO准确配制SPDP母液，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为 20-30 1,50-100 1，混勻、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。 取DTT按50-100 1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去 多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1 2-3混勻，铝箔封好后于20-25°C振荡 反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。RPC标记抗荧光抗抗体的纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC法 进行荧光抗抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min, 检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格 7. 5mmX60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来(附图1)。目标产物的洗脱峰面积占所有 洗脱峰面积的比例即为交联效率。收集各洗脱峰，进行光谱学、抗体活性、电泳检测。 RPC标记荧光抗抗体的光谱检测吸收光谱在紫外-可见光分光光度计上测定，扫 描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，用540nm的激发光 激发，荧光发射波长扫描范围为550-700nm，检测步长为0. 2nm，狭缝宽度为3nm，检测灵敏 度为中等，扫描速度为lOOOnm/min，每个样品扫描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作 背景扣除。在紫外区，RPC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照RPC，吸收峰位置相同，这 是因为RPC表面交联了抗抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围 内，交联物的吸收光谱与对照RPC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗抗体在该范围内无光 吸收，因而不影响RPC的吸收光谱。通过吸收光谱检测可判定交联成功，同时交联反应没有 导致RPC变性。RPC标记荧光抗抗体与对照RPC在540nm激发光的激发下，室温荧光发射波 长均位于632nm，没有发生斯托克位移的改变，仍具有RPC的特征荧光发射光谱，且荧光亮 度无明显降低。荧光光谱检测结果再次证实RPC与抗抗体交联成功。RPC标记荧光抗抗体的效价检测对流免疫电泳法检测RPC标记荧光抗抗体的免 疫学活性。RPC标记荧光抗抗体与动物IgG形成青色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察 到沉淀线的位置。免疫沉淀线的形成说明抗抗体与RPC交联成功，同时也说明交联反应对 抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物能够进行抗原抗体反应，仍然保留较高的抗体活性。RPC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%。恒压电泳，电压为218V。用0. 25% (w/v)考马斯 亮蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现RPC标记荧光抗抗体既具有RPC的 α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带(附图2)，证实RPC与抗抗体交联成功。RPC标记荧光抗抗体的稳定性检测纯化的RPC标记荧光抗抗体中加入0. 02%叠 氮化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价。R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｒ－藻蓝蛋白（ＲＰＣ）标记的荧光抗抗体的制备方法，包括：阴离子交换层析法制备多管藻ＲＰＣ，分别用摩尔比２０－３０∶１、５０－１００∶１的交联剂ＳＰＤＰ将ＲＰＣ、抗抗体衍生，抗抗体的ＳＰＤＰ衍生物经摩尔比５０－１００∶１的ＤＴＴ还原获得带－ＨＳ的抗抗体，带－ＨＳ的抗抗体与ＲＰＣ的衍生物以摩尔比１∶２－３液相交联，经ＨＰＬＣ纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的间接免疫荧光检测。

【技术特征摘要】
一种R 藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法，包括阴离子交换层析法制备多管藻RPC，分别用摩尔比20 30∶1、50 100∶1的交联剂SPDP将RPC、抗抗体衍生，抗抗体的SPDP衍生物经摩尔比50 100∶1的DTT还原获得带 HS的抗抗体，带 HS的抗抗体与RPC的衍生物以摩尔比1∶2 3液相交联，经HPLC纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的间接免疫荧光检测。2.根据权利要求1的方法，其中RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离 纯化，纯化步骤为取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)，4°C下溶胀24h， 多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60% (w/v)，4°C放置 24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液 (pH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子 交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品和杂质，用20mM醋 酸缓冲液(PH4. 8)(含50mM NaCl) 一步洗脱就可得到大量纯的RPC，纯化的多管藻RPC纯度 达电泳纯，纯度指数A62tZA28tl >4. 5，结构式为(α β)3，分子量约为llOkDa，最大吸收峰分 别位于...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽萍，颜世敢，颜士勇，
申请(专利权)人：颜世敢，
类型：发明
国别省市：88[]