本公开提供检测和分析获自试验受试者的样品中的KRT4和KRT17表达的方法。本公开涉及鉴定患有子宫颈癌或子宫颈非癌性病变的哺乳动物受试者的方法与试剂盒。本公开进一步提供了通过测定样品中的KRT17表达水平来确定患有子宫颈癌的受试者的存活期可能性或治疗效果的方法与试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年8月8日提交的美国临时申请号61/863,671和2013年8月14日提交的美国临时申请号61/865,750的权益，其全部内容经此引用并入本文。关于联邦资助研究的声明本公开在美国国立卫生研究院授予的基金号码AI091175和CA140084的政府支持下进行。政府在本公开中具有某些权利。
本公开涉及诊断子宫颈异常的方法，所述子宫颈异常表明在受试者中存在子宫颈癌或存在癌前期病变。本公开进一步提供了分析受试者体内的角蛋白4和角蛋白17的蛋白表达水平以确定在受试者体内存在子宫颈癌或存在癌前期病变的方法。本公开进一步涉及分析受试者体内的角蛋白17以预测患者的预后和存活期的方法。专利技术背景子宫颈癌是全球妇女死亡的第二主要原因，但是在大多数工业化国家是癌症死亡率的不太常见的原因，主要是因为子宫颈癌筛查细胞学(即“巴氏试验”)的成功。在美国，在2012年报道了12,200例新诊断病例和4,200例癌症死亡。参见Siegel R等人,CA:A CancerJournal for Clinicians.2012；62:10-29。此外，三百万宫颈细胞学标本具有异常的细胞学发现，需要通过阴道镜进一步评估。参见Schiffman M等人,JNCI.2011；103:368-83。尽管高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测广泛用于提高子宫颈癌筛查的准确性，阳性检测结果对进行未明确意义的非典型鳞状细胞(ASC-US)或低度鳞状上皮内病变(LSIL)的细胞学诊断的患者体内潜在的高度鳞状上皮内病变(HSIL)或鳞状细胞癌具有不佳的特异性，因为大多数HPV感染是短暂的，不太可能导致恶性转化。参见Wright TCJ.J Fam Pract.2009；58:S3-7。由于各种技术问题(例如染色的特异性)或导致假阴性或假阳性诊断的诊断挑战(例如缺少独特的生物标记物)，HSIL的组织学分类也可能会有问题。虽然p16INK4a/Ki-67双染色法和其它生物标记物可能提供客观依据来支持HSIL和鳞状细胞癌的组织学诊断，但大多数在高比例的LSIL中表达。参见例如Samarawardana P等人,Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.2011；19:514-8；Yamazaki T等人,Pathobiology.2006；73:176-82；和Masoudi H等人,Histopathology.2006；49:542-5。因此，仍然存在对以下的重要的临床需要：(i)鉴定新的子宫颈癌生物标记物，其能够在组织活检中改善HSIL/鳞状细胞癌相对正常/LSIL的检测的特异性；(ii)集中资源治疗最有可能从阴道镜和后续的治疗干预中获益的患者；(iii)以及避免过度治疗可能仅具有短暂HPV感染的患者。参见Narayan K.Int.J.Gynecol.Cancer.2005；15:573-82。此外，鳞状细胞癌患者中预后指标的验证可以改善他们的临床管理和治疗效果。例如，在临床实践中，大多数鳞状细胞癌患者接受根治性子宫切除术，并且根据肿瘤分期还可能接受术后化疗和放疗。但是，这些患者的治疗效果明显不同。参见例如Schwarz JK等人,JAMA.2007；298:2289-95；和Eifel PJ等人,J.Clin.Oncol.2004；22:872-80。鉴于上述缺点，本公开鉴定和验证了用于HSIL与鳞状细胞癌的生物标记物，其包括，例如角蛋白4(KRT4)和角蛋白17(KRT17)，并进一步表征KRT17为宫颈鳞状细胞癌患者的预后生物标记物。专利技术概述本公开表明，角蛋白4(KRT4)和角蛋白17(KRT17)是指示受试者体内存在子宫颈癌或存在癌前病变的用于诊断子宫颈癌和诊断子宫颈异常的预测性生物标记物。在本公开的一个方面，KRT4被验证为用于诊断宫颈鳞状细胞癌和高度鳞状上皮内病变(HSIL)的临床生物标记物。在某些实施方案中，当与正常对照样品、参比样品和/或低度鳞状上皮内病变(LSIL)相比时，在患有宫颈鳞状细胞癌和HSIL的受试者体内KRT4的表达降低。在本公开的另一方面，KRT17被鉴定为用于诊断患有或可能患有宫颈鳞状细胞癌的受试者的临床生物标记物。在某些实施方案中，当与正常对照样品或参比样品和/或低度鳞状上皮内病变(LSIL)相比时，在患有宫颈鳞状细胞癌和HSIL的受试者体内KRT17表达水平显著提高。在另一个实施方案中，在正常鳞状粘膜或表征为具有LSIL的受试者中，KRT17表达不存在或以可忽略水平测得，这表明在此类受试者体内不存在宫颈鳞状细胞癌或其癌前病变。综上所述，本公开表明，KRT4表达的丧失或降低和/或KRT17表达的提高是子宫颈癌进展中的一个关键事件。在本专利技术的方法中结合这一发现以鉴定患有子宫颈癌或其癌前病变的受试者。在本公开的一个方面，相对于非癌性对照样品或LSIL样品，在鳞状细胞癌样品中已经观察到KRT17表达水平的显著提高，这已经与存活期的降低的几率和/或负面治疗效果相关联。因此，在本公开的某些实施方案中，当在获自受试者的样品中检测到提高水平的KRT17表达时，与不具有相对于正常鳞状粘膜或对照样品KRT17表达提高的诊断患有子宫颈癌的受试者相比，该受试者可能具有存活期的降低的可能性和/或负面的治疗效果。附图概述图1：基于质谱法的生物标记物发现与基于免疫组织化学的生物标记物验证的实验设计。A.设计用于各诊断类别的组织微阵列。具体而言，正常：非癌性外宫颈鳞状粘膜，LSIL：低度鳞状上皮内病变，HSIL：高度鳞状上皮内病变，SCC：鳞状细胞癌。B.基于基因本体分类的由福尔马林固定石蜡包埋的存档宫颈组织鉴定的蛋白的亚细胞定位。显示了各亚细胞类别的蛋白百分比。图2：鳞状细胞癌中的角蛋白4表达检测。A.在代表性病例中的角蛋白4(KRT4)免疫组织化学染色。正常：非癌性外宫颈鳞状粘膜，LSIL：低度鳞状上皮内病变，HSIL：高度鳞状上皮内病变，SCC：鳞状细胞癌。比例尺条表示50微米。B.基于PathSQ免疫组织化学评分的各诊断类别中的KRT4表达数据，所述评分基于具有强染色的阳性细胞的百分比(n＝每个诊断类别25-27个病例)。平均值(粗虚线)和中值(实线)。*p>0.001，根据Kruskal-Wallis和Wilcoxon秩和检验。图3：高度鳞状上皮内病变与鳞状细胞癌中的角蛋白17检测。正常：非癌性外宫颈鳞状粘膜，LSIL：低度鳞状上皮内病变，HSIL：高度鳞状上皮内病变，SCC：鳞状细胞癌。A.在来自各诊断类别的代表性病例中的角蛋白17(KRT17)免疫组织化学染色。比例尺条表示50微米。B.基于PathSQ免疫组织化学评分的各诊断类别中的KRT17表达数据，通过表现出强染色的阳性细胞百分比测定(n＝每个诊断类别25-27个病例)。平均值(粗虚线)和中值(实线)。*p>0.05，根据Kruskal-Wallis和Wilcoxon秩和检验。图4：角蛋白17表达与非癌性病理的关联。A.在获自患有以下疾病的受试者的样品中未观察到KRT17表达的统计学显著变化：不成熟鳞状上皮化生、成熟鳞状上皮化生、炎症(宫颈炎)、伤口愈合(活检部位改变)或单纯疱疹病毒感染本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴定患有子宫颈癌的哺乳动物受试者的方法，包括获得来自受试者的样品，并检测获自所述受试者的处理过的样品中的KRT4和/或KRT17表达，其中处理过的样品中降低的KRT4表达水平或提高的KRT17表达水平将所述受试者鉴定为患有子宫颈癌。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.08 US 61/863671;2013.08.14 US 61/8657501.鉴定患有子宫颈癌的哺乳动物受试者的方法，包括获得来自受试者的样品，并检测获自所述受试者的处理过的样品中的KRT4和/或KRT17表达，其中处理过的样品中降低的KRT4表达水平或提高的KRT17表达水平将所述受试者鉴定为患有子宫颈癌。2.权利要求1的方法，进一步包括处理所述样品。3.权利要求2的方法，其中所述处理样品包括切割所述样品以分离细胞，在包含脲的裂解液中裂解所述分离的细胞，从裂解液中分离所述蛋白，在包含胰蛋白酶的消化溶液中消化分离的蛋白，并使所得混合物离心为肽。4.权利要求1的方法，其中所述样品选自：全血、组织、淋巴结或其组合。5.权利要求4的方法，其中所述样品是肿瘤活检样品或福尔马林固定石蜡包埋组织样品。6.权利要求1的方法，其中通过选自以下的方法测定样品中KRT4和/或KRT17表达的水平：采用免疫组织化学、免疫荧光测定、蛋白印迹法或ELISA的个体肿瘤活检样本或组织微阵列。7.权利要求1的方法，其中基于检测KRT4或KRT17 mRNA的水平来测量KRT4和/或KRT17表达的水平。8.权利要求1的方法，其中所述子宫颈癌是鳞状细胞癌。9.权利要求1的方法，其中基于比较样品中KRT4或KRT17表达水平与对照水平来确定所述降低的KRT4表达水平和/或所述提高的KRT17表达水平。10.权利要求9的方法，其中由受试者的健康组织、或由来自其它受试者的健康或癌性组织建立所述对照水平。11.权利要求10的方法，其中所述健康组...
【专利技术属性】
技术研发人员：KR什罗耶，LF埃斯科巴霍尤斯，EI陈，
申请(专利权)人：纽约州州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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