一种可再生的生物素结合蛋白芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可再生的生物素结合蛋白芯片及其制备方法，特征是取双链DNA，其中一条单链DNA的末端带有活性基团，另一条单链DNA为与生物素结合蛋白相连的互补链，将末端带有活性基团的单链DNA与具有纯金膜表面的固相载体或与表面带有活性基团的固相载体进行反应，形成物理吸附或共价连接，从而将单链DNA固定于固相载体表面；再通过单链DNA与互补链的碱基配对，将与互补链相连的生物素结合蛋白固定到固相载体表面，从而得到可再生的生物素结合蛋白芯片。该芯片比现有利用离子配对所固定的生物素结合蛋白的稳定性更好，且再生制备操作更简易，能够实现与现有商品化生物素结合蛋白芯片产品相同的功能；且适用于各种固相载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白芯片及其制备方法
，具体涉及可再生的生物素结合蛋白芯片及其制备方法。
技术介绍
据《现代预防医学》(2001,28.4:485-486)介绍，具有亲和分子层表面的载体介质，如亲和树脂、生物膜和生物芯片等，因其可以特异结合带特定结构的蛋白、多肽、DNA序列等，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞生物学、微生物学等领域，成为生物学的重要分析方法和手段之一。在众多的亲和分子层中，具有生物素结合蛋白结构的亲和芯片是较为常用的一种，它能特异性地结合带有生物素标签的蛋白、多肽、DNA、RNA等。但现有商品化的生物素结合蛋白芯片产品都是一次性使用的，因为其生物素结合蛋白分子层是通过共价键结合的方式固定到载体介质上的，如要进行再生处理，必须采用强氧化剂(如浓硫酸、硝酸、高氯酸、双氧水等)将载体介质表面的所有基质和生物素结合蛋白分子层进行彻底的消解，然后再重新构建表面基质和生物素结合蛋白分子层，这样的再生方法操作复杂，费时费力，成本也高，且需用到强氧化剂和有机溶剂会造成环境污染，因此现有商品化的生物素结合蛋白芯片产品一般都是不做再生处理的。中国专利申请号200910144805.2公开的《一种可再生的生物素结合蛋白分子层及其制备方法》，利用氮川三乙酸分子可通过金属离子捕获带组氨酸标签分子的特点，通过将具有氮川三乙酸结构的分子层先后在金属离子和带组氨酸标签的生物素结合蛋白溶液中进行浸泡，制备出了具有生物素结合蛋白表面的分子层。由于此生物素结合蛋白分子层可以通过金属离子螯合剂洗脱下来，因此具有可再生、可重复利用的性质。但该方法是通过螯合离子后再配对带组氨酸标签的生物素结合蛋白，螯合的离子本身就不是非常稳定，力口上离子配对带组氨酸标签的生物素结 合蛋白一般只有2-6个结合位点，因此其整体结构稳定性还不是很好，而且再生制备过程需要重复两个步骤，即须先后在金属离子和带组氨酸标签的生物素结合蛋白溶液中浸泡，再生效率尚不够理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出，以克服现有生物素结合蛋白芯片不可重复使用的缺点。本专利技术的可再生生物素结合蛋白芯片的制备方法，通过可再生的DNA配对方式固定事先经过修饰的生物素结合蛋白分子；其特征在于:取一种双链DNA，其中的一条单链DNA的末端带有活性基团，另一条单链DNA为与生物素结合蛋白相连的互补链；首先将末端带有活性基团的单链DNA，与具有纯金膜表面的固相载体，或与表面带有活性基团的固相载体进行反应，形成物理吸附或共价连接，从而将该单链DNA固定于固相载体表面；再通过该单链DNA与互补链的碱基配对，将与互补链相连的生物素结合蛋白固定到固相载体表面，从而得到可再生的生物素结合蛋白芯片。所述生物素结合蛋白选自卵白素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)或中性亲和素(Neutravidin)0所述活性基团选自巯基(-SH)、氨基(-順2)、羧基(-C00H)或醛基(-CH0)。所述固相载体选自玻璃片、硅片、塑料片、亲和树脂、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙乙烯，或它们的微粒。采用本专利技术的上述方法制备得到的本专利技术的可再生的生物素结合蛋白芯片，其特征在于:该芯片的固相载体表面具有双链DNA结构，其中一条单链DNA通过物理吸附或共价连接的方式固定在固相载体表面，另一条单链DNA为与生物素结合蛋白相连的互补链，通过单链DNA与互补链的碱基配对使得与互补链相连的生物素结合蛋白固定在固相载体表面；所述生物素结合蛋白选自卵白素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)或中性亲和素(Neutravidin)0所述固相载体选自玻璃片、硅片、塑料片、亲和树脂、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙乙烯，或它们的微粒。本专利技术的制备方法由于采取先将单链DNA固定在固相载体表面，再利用DNA碱基互补配对的原理，把与生物素结合蛋白相连的互补链固定到固相载体上，制备出了具有生物素结合蛋白表面的蛋白芯片。该生物素结合蛋白芯片通过采用0.001-10M碱溶液进行冲洗，便能破坏固相载体表面的双链DNA结构，使得与生物素结合蛋白相连的互补链被洗脱下来，再次进样与生物素结合蛋白相连的互补链，便可重新制备出生物素结合蛋白芯片。因此这种生物素结合蛋白芯片具有可再生、可重复利用的性质。 本专利技术的制备方法与现有专利申请号200910144805.2的方法及其产物相比较，由于本专利技术利用了 DNA碱基互补配对的原理，其配对结合位点一般有10-80个之多，而现有技术通过螯合离子后再配对带组氨酸标签分子的离子配对方式一般只有2-6个结合位点，而且现有技术螯合的离子的稳定性远不及本专利技术方法通过物理吸附或共价连接所固定的单链DNA，因此本专利技术的制备方法所固定的生物素结合蛋白的稳定性比现有技术利用离子配对所固定的生物素结合蛋白的稳定性更好；另外，本专利技术方法的再生制备过程只需要重复进行一个步骤，即只需洗脱后再次进样与生物素结合蛋白相连的互补链，便可重新制备出生物素结合蛋白芯片，而现有技术则需要重复两个步骤，即洗脱后在金属离子和带组氨酸标签的生物素结合蛋白溶液中先后浸泡，因此本专利技术方法的再生效率比现有专利申请号200910144805.2的方法更高。相比现有技术利用螯合金属离子后再配对带组氨酸标签分子的特点，采用本专利技术方法制备得到的可再生生物素结合蛋白芯片由于利用了 DNA碱基互补配对的原理，具有更好的稳定性，能够稳定地结合带有生物素标签的分子，因此能够实现与现有商品化的生物素结合蛋白芯片产品相同的功能。相比现有商品化的一次性使用的生物素结合蛋白芯片，由于是通过共价键结合的方式将生物素结合蛋白固定到载体上的，如要进行再生处理只能用强氧化剂将载体介质表面的所有基质和生物素结合蛋白分子层进行彻底的消解，然后再重新构建基质和生物素结合蛋白分子层，这种再生方法操作复杂，费时费力，成本也高，且需用到强氧化剂和有机溶剂从而造成环境污染；而本专利技术的可再生生物素结合蛋白芯片是通过DNA碱基互补配对的方式将生物素结合蛋白固定到载体上的，因而具有可再生、可重复利用的优点，而且再生制备过程只需要重复进行一个步骤，操作简易，反应条件温和，并可适用于各种固相载体。采用本专利技术的方法制备得到的生物素结合蛋白芯片可广泛应用于生物学、医学领域，如与表面等离子共振技术相结合，进行生物学分析或临床诊断。附图说明图1为实施例1中可再生链霉亲和素芯片的制备以及使用该芯片结合生物素和对此进行再生处理的表面等离子共振信号曲线；图2为同一个芯片上重复实施例1中可再生链霉亲和素芯片的制备以及使用该芯片结合生物素和对此进行再生处理的表面等离子共振信号曲线。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步具体说明。实施例1:本实施例 是以表面为纯金膜的玻璃片来制备本专利技术的可再生生物素结合蛋白芯片。具体步骤为:第一步、取一种双链DNA，其中的一条单链DNA (碱基序列:5’CATCTGACCTCTGTGCTGCT)的末端带有活性基团巯基(-SH)，另一条单链DNA为与链霉亲和素相连的互补链(碱基序列:5’ AGCAGCACAGAGGTCAGATG)；第二步、将表面为纯金膜的玻璃片作为芯片的固相载体置于表面等离子共振相互作用分析仪中，然后以2 μ 1/min的流速注入含有5 μ M末端为巯基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可再生生物素结合蛋白芯片的制备方法，通过可再生的DNA配对方式固定事先经过修饰的生物素结合蛋白分子；其特征在于：取一种双链DNA，其中的一条单链DNA的末端带有活性基团，另一条单链DNA为与生物素结合蛋白相连的互补链；首先将末端带有活性基团的单链DNA，与具有纯金膜表面的固相载体，或与表面带有活性基团的固相载体进行反应，形成物理吸附或共价连接，从而将该单链DNA固定于固相载体表面；再通过该单链DNA与互补链的碱基配对，将与互补链相连的生物素结合蛋白固定到固相载体表面，从而得到可再生的生物素结合蛋白芯片。

【技术特征摘要】
1.一种可再生生物素结合蛋白芯片的制备方法，通过可再生的DNA配对方式固定事先经过修饰的生物素结合蛋白分子；其特征在于: 取一种双链DNA，其中的一条单链DNA的末端带有活性基团，另一条单链DNA为与生物素结合蛋白相连的互补链； 首先将末端带有活性基团的单链DNA，与具有纯金膜表面的固相载体，或与表面带有活性基团的固相载体进行反应，形成物理吸附或共价连接，从而将该单链DNA固定于固相载体表面； 再通过该单链DNA与互补链的碱基配对，将与互补链相连的生物素结合蛋白固定到固相载体表面，从而得到可再生的生物素结合蛋白芯片。2.按权利要求1所述可再生生物素结合蛋白芯片的制备方法，特征在于所述生物素结合蛋白选自卵白素、链霉亲和素或中性亲和素。3.按权利要求1所述可再生生物素结合蛋白芯片的制备方法，特征在于所述活性基团选自巯基(-SH)、氨基(-NH2)、羧基(...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧惠超，罗昭锋，周宏敏，罗炎，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：