破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白（ＰＥＸ）以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量制造技术

通过改变过氧化物酶体生物合成因子（Ｐｅｘ）蛋白的活性，已经成功地找到在生产ＰＵＦＡ的含油真核生物中的总脂质级分和油级分中提高多不饱和脂肪酸（ＰＵＦＡ）的量的方法。在与不破坏天然Ｐｅｘ蛋白的亲本菌株比较时，在生产ＰＵＦＡ的含油真核生物菌种中破坏染色体Ｐｅｘ３基因、Ｐｅｘ１０ｐ基因或Ｐｅｘ１６ｐ基因，导致在菌株的总脂质级分和油级分中的ＰＵＦＡ量提高，所述ＰＵＦＡ的量以总脂肪酸百分比和干细胞重量百分比形式表示。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物
更具体地讲，本专利技术涉及基于破坏过氧化物酶体生物 合成因子(PEX)蛋白的、用于操纵真核生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)组成和脂质含量的方法。
技术介绍
已经有大量文献证明了与多不饱和脂肪酸[“PUFA”]，尤其是ω-3和(0-6PUFA 相关的健康有益效果。为了寻找大规模制备ω-3和ω-6PUFA的方法，研究者已经将他们的工作转向发现基因以及了解产生脂质和脂肪酸 的编码的生物合成途径。一个用于生产这些PUFA的研究成果已经将ω -3/ ω -6PUFA生物合成途径导入了 不会天然产生《-3/co-6PUFA的生物体中。一种已经被广泛使用的所述生物是非含油酵 母，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。然而，并无初步结果证明有限产量的亚油酸 [LA]、γ -亚麻酸[GLA]、α -亚麻酸[“ALA”]、十八碳四烯酸[STA]和/或二十 碳五烯酸[“EPA”]适于商业开发。其它用于大规模生产co-3/co-6PUFA的研究成果已经培育出了天然生产选定脂 肪酸的微生物，例如异养硅藻小环藻属(Cyclotella sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)、 假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)或希瓦氏菌(Shewanella)、 腐霉属(Pythium)的丝状真菌、或长被孢霉属(Mortierella elongata)、M. exigua或 M. hygrophila。然而所有这些研究成果都不能够充分地改善油产量或控制所生产的油的组成的 特性，因为发酵依赖微生物本身的天然能力。共有的美国专利7，238，482描述了使用含油酵母解脂耶氏酵母作为生产宿主用 于生产PUFA的用途。含油酵母被定义为是那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中细 胞干重一般大于25%。本领域已经描述了生产宿主的优化(参见例如国际申请公开WO 2006/033723、美国专利申请公开2006-0094092、美国专利申请公开2006-0115881、和美国 专利申请公开2006-0110806)。本文所述的重组菌株包含多种嵌合基因，所述基因表达多拷 贝的异源去饱和酶、延伸酶和酰基转移酶，并且任选地包含多个天然去饱和酶和酰基转移 酶敲除以能够合成并积聚PUFA。商业生产PUFA需要对宿主细胞进行进一步优化。Lin Y.等人提出过氧化物酶体是脂质的分解代谢和合成代谢所必需的(Plant Physiology, 135 :814_827 (2004))。然而，该假说是以对拟南芥属突变体中的Pexl6p同源 物的研究为基础的，该突变体具有异常的过氧化物酶体生物合成以及脂肪酸合成(即，据 报道ssel种子中生产的油比野生型减少了大约10-16%)。Birms，D.等人(J. Cell Biol.,4173(5) 719-731(2006))也提供了证明过氧化物酶体和脂质体在啤酒糖酵母中的密切协 作的文献。但是以前尚未在生产PUFA的生物中进行过对Pex敲除的研究。申请人:已经通过在生产PUFA的生物体中破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白的 非预知机制，解决了优化宿主细胞以用于PUFA商业生产的所述问题，所述机制导致在解脂 耶氏酵母的重组PUFA生产菌株中提高PUFA量(以总脂肪酸百分比形式表示)的非预知结 果。本文描述了在过氧化物酶体生物合成因子蛋白中存在破坏的新型菌株。专利技术概述本文所述的是提高在具有总脂质含量、总脂质级分和油级分的含油真核生物中至 少一种多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的重量％相对于总脂肪酸[“TFA”]的重量％的方法， 所述方法包括a)提供含油真核生物，所述含油真核生物包含1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因；和2)在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，由此提供PEX破 坏的生物，以及b)使所述PEX破坏的生物在以下条件下生长即，使得当与编码过氧化物酶体生 物合成因子蛋白的天然基因未被破坏的含油真核生物中的总脂质级分或油级分中相对于 总脂肪酸的重量百分比的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比进行比较时，所述总脂质 级分或油级分中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提尚ο该提高方法也可通过实施相同步骤(a)和(b)，用于提高至少一种多不饱和脂肪 酸[“PUFA”]相对于干细胞重量[DCff]的百分比。在本文所述的一些方法中，PUFA重量％相对于TFA重量％提高了至少1. 3倍。在一些所述方法中，PEX破坏的生物体中的总脂质含量与天然PEX基因中无破坏 的含油真核生物的总脂质含量相比可能提高或降低。在这些方法的任何一种中，提高的PUFA可以是单个PUFA或多个PUFA的组合。在 任一种情况下，提高的PUFA或提高的PUFA组合可以包括亚油酸、共轭亚油酸、Y -亚麻酸、 二高-Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6 二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八 碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3 二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯 酸、二十二碳六烯酸、这些脂肪酸的羟基化或环氧脂肪酸、C18多不饱和脂肪酸或这些脂肪酸 的组合、C2tl多不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的组合、C2ch22多不饱和脂肪酸的组合和C22多不 饱和脂肪酸或这些脂肪酸的组合。在这些方法的任何一种中，PEX破坏的生物可以是以下生物的一员耶氏酵 母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属 (Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、油脂酵母 属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属 (Schizochytrium)、和糖酵母属(Saccharomyces)，上述生物都具有含油特性。并且，在任 何一种所述方法中，PUFA生物合成途径包括编码以下酶的任何一种或它们的组合的基因 Δ 9去饱和酶、Δ 12去饱和酶、Δ 6去饱和酶、Δ 5去饱和酶、Δ 17去饱和酶、Δ 8去饱和酶、 Δ 15去饱和酶、Δ 4去饱和酶、C14716延伸酶、C16718延伸酶、C18720延伸酶、C20722延伸酶和Δ 9延伸酶。破坏可发生在编码以下过氧化物酶体生物合成因子蛋白的PEX基因中，所述蛋 白包括Pexlp、Pex 2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、 Pex7p、Pex8p、PexlOp、Pexl2p、Pexl3p、Pexl4p、Pexl5p、Pexl6p、Pexl7p、Pexl4/17p、 Pexl8p、Pexl9p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p 样禾口 Pex26p。并且在这些方法 的任何一种中，破坏可以是编码蛋白的C-末端部分的基因的一部分中的基因敲除或缺失。 在这些方法的任何一种中，缺失发生在编码蛋白的C3HC4环状锌指基序的C-末端部分的基 因部分。本文也描述了 PEX破坏的生物中的油级分或总本文档来自技高网...

【技术保护点】
使具有总脂质含量、总脂质级分和油级分的含油真核生物中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提高的方法，所述方法包括：ａ）提供含油真核生物，所述含油真核生物包含：１）编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因；和２）在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，由此提供ＰＥＸ破坏的生物，以及ｂ）使所述ＰＥＸ破坏的生物在以下条件下生长：即，使得当与编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被破坏的含油真核生物中的总脂质级分或油级分中相对于总脂肪酸的重量百分比的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比进行比较时，所述总脂质级分或油级分中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-10-3 60/977174使具有总脂质含量、总脂质级分和油级分的含油真核生物中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提高的方法，所述方法包括a)提供含油真核生物，所述含油真核生物包含1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因；和2)在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，由此提供PEX破坏的生物，以及b)使所述PEX破坏的生物在以下条件下生长即，使得当与编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被破坏的含油真核生物中的总脂质级分或油级分中相对于总脂肪酸的重量百分比的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比进行比较时，所述总脂质级分或油级分中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提高。2.提高含油真核生物中至少一种多不饱和脂肪酸相对于干细胞重量的百分比的方法， 所述方法包括a)提供含油真核生物，所述含油真核生物包含1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因；和2)在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，由此提供PEX破坏的 生物，以及b)使所述PEX破坏的生物在以下条件下生长即，使得当与编码过氧化物酶体生物合 成因子蛋白的天然基因未被破坏的含油真核生物中至少一种多不饱和脂肪酸相对于干细 胞重量的百分比进行比较时，所述至少一种多不饱和脂肪酸相对于所述干细胞重量的百分 t匕提尚ο3.权利要求1或2的方法，其中当与编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因 未被破坏的含油真核生物中的总脂质级分或油级分中相对于总脂肪酸的重量百分比的多 不饱和脂肪酸的重量百分比进行比较时，所述至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对 于总脂肪酸的重量百分比的提高为至少1. 3。4.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸选自亚油酸、共轭亚油酸、Y-亚麻酸、二高-Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、 ω_6 二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3 二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、这些脂肪酸的羟基化或 环氧脂肪酸、C18多不饱和脂肪酸、C20多不饱和脂肪酸、和C22多不饱和脂肪酸。5.权利要求1的方法，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸由多不饱和脂肪酸的组合组 成，并且其中所述组合的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比被提高。6.权利要求4的方法，其中所述多不饱和脂肪酸的组合由两种或更多种选自下组的多 不饱和脂肪酸的任何组合组成亚油酸、共轭亚油酸、Y-亚麻酸、二高-Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、 ω_6 二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3 二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、这些脂肪酸的羟基化或 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z薛，QQ朱，NS亚达夫，PL夏普，SP洪，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]