大视场、高分辨率的显微镜制造技术

显微镜系统包括：光源、样本物镜、样本物镜、远程聚焦单元、一个或多个光学元件和检测器；其中样本物镜配置为用于将光聚焦在样品内的焦平面上；远程聚焦单元配置为用于沿着垂直于所述焦平面的轴线改变所述焦平面的位置；一个或多个光学元件配置为用于将所述聚焦光引导至所述焦平面内的位置；检测器配置为检测从所述样品内的所述焦平面发射的光；其中所述一个或多个光学元件沿着从所述源到所述样本物镜的光的光束路径位于所述远程聚焦单元之后，从而在将聚焦的光引导到焦平面内的位置之前执行沿所述轴线改变所述焦平面的位置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大视场、高分辨率的显微镜相关申请的交叉引用本申请要求于2015年11月1日提交的美国临时专利申请62/249,342、于2016年1月22日提交的美国临时专利申请62/286,108、于2016年1月23日提交的美国临时专利申请62/286,317，以及于2016年1月28日提交的美国临时专利申请62/288,122的优先权。美国临时专利申请62/249,342、62/286,108、62/286,317和62/288,122的公开内容通过引用并入此文。
本专利技术涉及显微镜，尤其涉及具有大视场的高分辨率双光子显微镜(TPM)。
技术介绍
双光子显微镜(TPM)即便在散射组织中成像时也可以提供高分辨率和高对比度。TPM可用于分辨单个细胞，例如在组织中达到1毫米深的神经元和亚神经元结构。TPM已被广泛用于测量完整脑内的神经元群体中的动态过程，例如钙动力学，甚至是在动物行为期间。多达数百个神经元被同时成像，但很大程度上局限于单个脑区域内的半毫米数量级的视场。在点扫描的激光扫描显微镜(LSM)中，聚焦激光在三维空间内在样品上移动。在垂直于扫描光束的光轴的平面(x-y平面)中可以相对容易地实现激光扫描，但激光扫描沿着光轴(z)更具挑战性，激光扫描平行于光束的方向更具挑战性。在很多显微镜中，要沿光轴扫描光束，物镜会物理移动以改变焦点的z位置，但这涉及移动较大的物体，因此速度相对缓慢，限制了能够采集的图像类型以及实际可以设计的显微镜的类型。或者，支撑样品的台架可以沿着光轴移动，同时物镜的位置保持固定，但是这也涉及移动大的物体。在保留细胞分辨率的同时，几类应用将从具有更大视场的显微镜中受益。即使是相对简单的动物行为也涉及多个大脑区域，这些大脑区域通常是非连续的。探索在空间上分离的这些大脑区域的相互作用需要几乎同时对多个大脑区域进行成像。在灵长类动物中，感兴趣的皮质区域通常在脑回中相隔几毫米。其他应用包括追踪发育胚胎中的细胞结构。使用标准显微镜不可能同时对多个大脑区域进行成像。高分辨率显微镜具有小视场，而大视场显微镜不具有细胞分辨率。神经活动的敏感蛋白质指标(如钙指标)和表达这些指标的转基因动物的出现为中尺度成像开放了可能。要注意的是中尺度显微镜定义为成像时具有细胞分辨率和跨越多个大脑区域或整个有机体(几毫米)的视场。
技术实现思路
根据一个实施例的中尺度显微镜在本文中被描述为包括大约5mm数量级或更大的视场，其允许，例如对几乎共面的小鼠脑中的大部分皮层区域采样。显微镜具有更好的细胞分辨率，这意味着显微镜的双光子激发体积远小于体细胞的标准尺寸(例如，直径约为10μm)。对于一些实施例，选择0.6的显微镜激励的数值孔径(NA)，其提供大约0.5μm的横向分辨率和大于4μm的轴向分辨率。显微镜在激发光束波长范围内(例如，在910-1070nm的波长范围内(例如，在基于绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)和各种红色的荧光蛋白的荧光蛋白传感器使用双光子激发来激发的波长范围内))产生衍射受限的性能和高双光子激发效率，但是也可以采用其他激发波长。此外，例如，通过使用大于激发数值孔径(NA)(0.6)的聚集物镜NA，显微镜具有用于聚集荧光信号的高聚集效率。中尺度扫描显微镜的关键挑战是速度。更快的扫描提供了更好的时间分辨率来测量神经活动，减少光损伤，以及追踪更多神经元的可能性。快速扫描方法可以使用多个共振镜和多个声光偏转器(AODs)。然而，多个共振镜和多个AOD都具有相对较小的扫描角，从而在样品平面内产生不会跨越整个视场的扫描。本专利技术的一些实施例通过使用具有多个顺序连接的扫描器的扫描引擎来解决该问题。例如，在一些实施例中，共振扫描仪(例如，具有24kHz线速率)可以产生大约0.5毫米的快速扫描，而较慢的检流计扫描仪(例如，具有1kHz线速率)可以提供跨越显微镜整个视场的偏转。这就允许以随机路径的方式在样品上移动快速共振扫描，以便对在广泛分散的大脑区域中的活动进行几乎同时采样。另一个挑战是控制激发光束沿显微镜的光轴(z轴)的扫描。在典型的扫描显微镜中，通过移动激发物镜来控制显微镜焦平面的z轴位置，其发生速度比焦平面内的x-y扫描慢两个数量级或更多。这对于中尺度成像是不可接受的，因为在不同大脑区域内几乎同时采样的感兴趣结构可以在z方向上相差数百微米的焦平面中。然而，本专利技术的一个实施例通过实施快速形式的远程聚焦来解决该问题。在双光子激发显微镜中，已经设计了多种用于大视场的仪器。Tsai等人(“Ultra-largefield-of-viewtwo-photonmicroscopy”，OpticsExpress23：13833-13847)设计了基于现成组件的扫描系统，它会产生10mm的扫描场。Stirman等人(“Widefield-of-view,twin-regiontwo-photonimagingacrossextendedcorticalnetworks.”，bioRxiv)使用了一个定制的物镜，它容许3.5mm的视场。但是，这两种系统都不能提供细胞级的分辨率。这些装置依赖于标准和慢速的检流计镜(例如，具有290Hz的线速率)，这对于许多类型的功能成像来说太过缓慢。此外，显微镜仅校正一个激发波长(分别为800nm和910nm)，限制其用于荧光分子的一小团。这些显微镜具有对于荧光聚集来说相对小的数值孔径，与标准TPM显微镜相比，这降低了信号产出(即检测到的荧光光子的比例)并且使信噪比降低了数倍。最后，这些显微镜不能实现快速的轴向扫描。本文公开了双光子随机路径中视镜(2p-RAM)的设计、构造和表征，其提供具有显微镜可见的分辨率的随机路径容量。2p-RAM可以在x方向和y方向上的大于5mm的视场范围内提供衍射受限的分辨率，在z方向上远程聚焦约1mm数量级或更多，并且提供组织容量的随机路径扫描。显微镜特定实施例的规格包括：·5mm视场(FieldOfView，FOV)——例如，对应于小鼠大脑的扁平部分。·910-1070nm激发光-当使用双光子激发时，与基于GFP和基于红色荧光蛋白(RFP)的荧光分子均兼容。·具有激发NA＝0.6的衍射受限的分辨率(点扩散函数，大约横向x0.6μm轴向4μm)-小于一个神经元。·聚集NA＝1.0；用于高效率信号检测。·对三重保护玻璃(450μm的玻璃)的完整的校正。·针对双光子激发进行了优化——这意味着所有视场点穿过显微镜光圈的传播时间延迟差＜20fs(rms)。·工作距离＞3mm。·在整个FOV中斯特列尔比(Strehlratio)＞0.8。·通过对超过＞700μm深度范围的整个横向视场完全光学校正，进行快速远程对焦——可能由于样本物镜(这是样本旁边的浸液物镜)和远程聚焦物镜的定制、匹配设计。为了用显微镜在平面内扫描光束，使用与多个较慢扫描仪顺序连接的的共振扫描，其用作中继设备并且还允许我们在整个视场范围内移动共振扫描的光束(例如在样品平面中+/-600μm)。例如，可以使用来回扫描，其中一组扫描仪定位共振扫描FOV扫描。使用扫描镜作为中继设备可以大大减少像差，并可以使有效地大扫描角度成为可能。这里公开了一种新形式的远程聚焦，其允许我们在大约几毫秒数量级的时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.显微镜系统，包括：光源(103)；样本物镜(104)，其配置为用于将光聚焦在样品(105)内的焦平面上；远程聚焦单元(102)，其配置为用于沿着垂直于所述焦平面的轴线改变所述焦平面的位置；一个或多个光学元件(103)，其配置为用于将所述光引导至所述焦平面内的位置；和检测器(106)，其配置为检测由所述样品内的所述焦平面发射出的光，以响应聚焦光；其中所述一个或多个光学元件(103)沿着从所述源到所述样本物镜的光的光束路径位于所述远程聚焦单元(102)之后，从而在将光引导到焦平面内的位置之前执行沿所述轴线改变所述焦平面的位置。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.01 US 62/249,342;2016.01.22 US 62/286,108;1.显微镜系统，包括：光源(103)；样本物镜(104)，其配置为用于将光聚焦在样品(105)内的焦平面上；远程聚焦单元(102)，其配置为用于沿着垂直于所述焦平面的轴线改变所述焦平面的位置；一个或多个光学元件(103)，其配置为用于将所述光引导至所述焦平面内的位置；和检测器(106)，其配置为检测由所述样品内的所述焦平面发射出的光，以响应聚焦光；其中所述一个或多个光学元件(103)沿着从所述源到所述样本物镜的光的光束路径位于所述远程聚焦单元(102)之后，从而在将光引导到焦平面内的位置之前执行沿所述轴线改变所述焦平面的位置。2.根据权利要求1所述的显微镜系统，其中所述聚焦光的大小是衍射受限的。3.根据权利要求1所述的显微镜系统，其中所述样本物镜具有第一有效数值孔径，所述第一有效数值孔径配置为用于向所述焦平面提供衍射受限的点，并且其中所述第一有效数值孔径至少为0.5。4.根据权利要求3所述的显微镜系统，其中所述第一有效数值孔径约为0.6。5.根据权利要求4所述的显微镜系统，其中所述样品物镜具有第二有效数值孔径，所述第二有效数值孔径配置为聚集从所述焦平面发射的光以成像到所述检测器上，并且其中所述第二有效数值孔径至少为1.0。6.根据权利要求1所述的显微镜系统，还包括聚光透镜(812)，所述聚光透镜沿着在所述焦平面和所述检测器之间发射的光的光束路径定位，所述聚光透镜配置成将所述发射的光聚焦到所述检测器上。7.根据权利要求6所述的显微镜系统，还包括浸液(808)，其位于所述聚光透镜(812)和所述检测器之间发射的光的光束路径中并且与所述聚光透镜和所述检测器接触。8.根据权利要求1所述的显微镜系统，其中所述光源向所述样品提供激发光，使得检测到的发射的光为荧光发射光，以响应聚焦的激发光。9.根据权利要求8所述的显微镜系统，其中激发光的波长是响应于双光子激发过程而生成的荧光发射光的波长的两倍长。10.根据权利要求1所述的显微镜系统，其中所述一个或多个光学元件形成横向扫描单元，所述横向扫描单元配置为用于扫描所述焦平面内的所述聚焦光。11.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述横向扫描单元包括配置为用于扫描所述焦平面内的所述激发光的焦点的第一可旋转镜(501)、第二可旋转镜(502)以及第三可旋转镜(503)；其中第一镜和第二镜(501、502)的旋转在同一平面内扫描激发光束，使得光束围绕所述第一镜和第二镜(501、502)下游的光瞳旋转；其中第三镜(503)位于所述光瞳处；和其中在与所述第一镜和所述第二镜(501、502)扫描所述光束的平面正交的平面内，所述第三镜(503)的旋转扫描所述激发光束。12.根据权利要求11所述的显微镜系统，其中所述横向扫描单元还包括与所述第一镜、第二镜和第三镜顺序设置的第四可旋转镜(230)。13.根据权利要求12所述的显微镜系统，其中所述第四镜的扫描速率高于所述第一镜、第二镜和第三镜的扫描速率，并且所述第四...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·斯沃博达，D·弗利金杰，N·索弗罗涅，
申请(专利权)人：霍华德休斯医学研究所，
类型：发明
国别省市：美国,US